基于銅離子顯色反應(yīng)的磁珠免疫分析快速檢測(cè)黃曲霉毒素B1

程慧，龔蕾，李詩(shī)瑤，彭青枝

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北武漢 430070）

醫(yī)學(xué)研究表明，黃曲霉毒素B1具有強(qiáng)烈的毒性和致癌性[1～4]。近年來(lái)，為了滿足現(xiàn)場(chǎng)食品檢測(cè)的需要，發(fā)展各種高靈敏免疫分析方法以用于真菌霉毒素的準(zhǔn)確檢測(cè)方法操作方便，成本較低，且信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)更加直觀簡(jiǎn)單，因此在實(shí)際應(yīng)用中具有較好發(fā)展前景[5～8]。相對(duì)于電化學(xué)、熒光和電化學(xué)發(fā)光等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，比色免疫分析法在方法簡(jiǎn)單、成本低及可快速直接得到結(jié)果等方面的優(yōu)勢(shì)明顯[9～12]。但是，如何提高比色免疫分析方法的靈敏度，降低傳統(tǒng)酶催化比色免疫分析方法的檢測(cè)成本仍然是該領(lǐng)域面臨的重要挑戰(zhàn)。

最近，大量具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)的有機(jī)配體可以選擇性地與不同金屬離子形成各種不同顏色、具有強(qiáng)吸附性能的復(fù)合物[13,14]?；诖?，金屬離子的顯色反應(yīng)被廣泛用于比色法。此外，為了有效降低傳統(tǒng)酶催化比色免疫分析方法的成本，同時(shí)增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，一些非酶標(biāo)記的金屬或金屬納米材料被用作標(biāo)記物[15～19]。這種金屬納米標(biāo)記物不僅可以直接檢測(cè)，而且在處理后很容易釋放大量的金屬離子。將非酶納米探針和金屬離子顯色反應(yīng)相結(jié)合，從而發(fā)展一種新的免疫比色法[20～23]。

根據(jù)之前報(bào)道合成的腙類(lèi)銅離子顯色劑可以與銅離子反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物[24]，通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜法測(cè)定該紅色溶液的吸光度，或直接通過(guò)目視比色法。本實(shí)驗(yàn)將磁珠免疫分析與銅離子顯色反應(yīng)相結(jié)合，發(fā)展了一種基于抗體功能化納米氧化銅信號(hào)示蹤的比色免疫分析檢測(cè)黃曲霉毒素B1。如圖1，基于磁珠免疫分析平臺(tái)，納米氧化銅標(biāo)記物和黃曲霉毒素B1被成功應(yīng)用于免疫反應(yīng)。定量結(jié)合的氧化銅標(biāo)記物可經(jīng)酸溶解釋放出高濃度的銅離子，加入腙類(lèi)銅離子顯色劑，即可生成紅色絡(luò)合物?；阢~離子和腙類(lèi)銅離子顯色劑形成的紅色絡(luò)合物作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)源，建立了一種新型比色免疫法用于定量檢測(cè)黃曲霉毒素B1。

圖1 基于抗體功能化CuO NP納米探針和Cu2+顯色反應(yīng)的免疫分析原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of immune analysis based on anti-AFB1 functionalized CuO NP probe and Cu2+ chromogenic reaction

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

黃曲霉毒素 AFB1標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于廈門(mén)波生生物技術(shù)有限公司；鼠抗AFB1單克隆抗體、AFB1-BSA、驢抗鼠二抗購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司；2-嗎啉乙磺酸(MES)、乙基-（3-二甲基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、腙類(lèi)銅離子顯色劑(DPHE)、CuO NPS均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；四氫呋喃(THF)等其他試劑均購(gòu)于上海國(guó)藥化學(xué)試劑公司；黃曲霉毒素B1、赭霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀烯酮、桔霉素、展青霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；抗壞血酸、腙類(lèi)銅離子顯色劑，疊氮酸鈉(NaN3)、2-嗎啉乙磺酸、乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、腙類(lèi)銅離子顯色劑：西格瑪(中國(guó))有限公司；黃曲霉毒素B1ELISA檢驗(yàn)試劑盒購(gòu)自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；納米磁珠、氧化銅納米粒子(CuO NP)：美國(guó)量子科學(xué)儀器公司。PBS緩沖溶液用作洗滌和結(jié)合緩沖液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

UV-3100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本日立公司；酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技有限公司；AB SCIEX 4500高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜：上海愛(ài)博才思分析儀器貿(mào)易有限公司；恒溫震蕩器：蘇州吉米諾儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗體功能化CuO NP納米探針的制備

將1 mg CuO NP分散于1.0 mL的10 mmol/L PBS 7.4中超聲10 min混勻，向其中加入100 μL 1.0 mg/mL驢抗鼠二抗室溫混勻組裝4 h，將所得產(chǎn)物離心洗滌除去過(guò)量的抗體后，分散于1.0 mL的10 mM PBS 7.4。之后再離心除去多余的 CuO NP后分散于 5%(m/V)BSA溶液中封閉反應(yīng)1 h。最后，將所得的抗體功能化CuO NP納米探針經(jīng)離心洗滌，分散于500 μL pH 7.4的PBS溶液中，4 ℃保存待用。

1.2.2 免疫磁珠的制備

采用EDC/NHS法將納米磁珠的羧基與鼠抗AFB1單克隆抗體上的氨基偶聯(lián)。2 mg磁珠用 500 μL MEST(10 mmol/L MES，pH 6.0，0.05%Tween 20)洗滌兩次，400 μL MES(10 mmol/L，pH 6.0)重懸浮磁珠后加入2 mg/mL EDC/NHS(現(xiàn)配現(xiàn)用)，置于渦旋儀上混勻使其充分懸浮，37 ℃活化 30 min。磁分離移除上清，加入500 μL MEST洗滌兩次，PBST(pH 7.4，含1%BSA)重懸后加入 40 μg鼠抗 AFB1單克隆抗體于4 ℃混勻過(guò)夜，磁分離移除上清，用500 μL PBST洗滌4次后重懸于1 mL PBST(pH 7.4，含0.02% NaN3，0.5% BSA)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測(cè)方法及步驟

首先，向制備的40 μL免疫磁珠中加入100 μL不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)樣品或樣品提取液，室溫震蕩15 min后通過(guò)PBS和PBST洗凈。之后，向其中加入140 μL CuO NP納米探針?lè)稚⒁?，繼續(xù)震蕩10 min之后利用pH 7.4 Tris-HCl充分洗凈。接著，加入10 μL 0.1 M HCl釋放出定量結(jié)合的銅離子，接著加入110 μL pH 7.0含有10 μM腙類(lèi)銅離子顯色劑的Tris-HCl/THF溶液，進(jìn)行顯色反應(yīng)得到紅色溶液，通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜法測(cè)定該紅色溶液的吸光度進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗體功能化CuO NP納米探針的顯色反應(yīng)

圖2紫外可見(jiàn)吸收光譜圖和相應(yīng)溶液的圖像Fig.2 UV-Vis absorption spectra and the photographs of the corresponding solutions(inset)

根據(jù)文獻(xiàn)方法，銅離子和腙類(lèi)銅離子顯色劑可以形成紅色絡(luò)合物[24]。如圖 2，腙類(lèi)銅離子顯色劑的紫外-可見(jiàn)吸收光譜在335 nm處呈現(xiàn)明顯的特征吸收，而4.0 μmol/L銅離子溶液在250～700 nm之間無(wú)特征吸收峰（曲線a和b）。將4.0 μmol/L銅離子溶液與10 μmol/L腙類(lèi)銅離子顯色劑混合后所得溶液在502 nm處呈現(xiàn)明顯的特征吸收，同時(shí)，腙類(lèi)銅離子顯色劑在335 nm處的特征吸收峰有所減弱（曲線c）。從插圖中我們不難發(fā)現(xiàn)在加入銅離子的腙類(lèi)銅離子顯色劑中出現(xiàn)明顯的由黃色到紅色的顏色變化過(guò)程。這一結(jié)果表明銅離子和腙類(lèi)銅離子顯色劑反應(yīng)形成了紅色絡(luò)合物，而且它們紫外特征吸收峰的差別更加有利于避免顯色劑對(duì)銅離子顯色的干擾。

圖3 磁珠對(duì)不同免疫顯色反應(yīng)紫外可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.3 UV-Vis absorption spectra recorded by different immunochromatographic reaction

將銅離子顯色反應(yīng)與抗體功能化CuO NP納米探針相結(jié)合以用于免疫反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖3）。通過(guò)磁珠免疫分析平臺(tái)上的免疫反應(yīng)，納米氧化銅標(biāo)記物被定量捕獲到磁珠表面形成磁性免疫復(fù)合物。在加入酸之后磁性免疫復(fù)合物釋放出定量捕獲的銅離子，該銅離子與顯色劑反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物以實(shí)現(xiàn)定量分析。從圖1B我們可以看出對(duì)100 ng/mL AFB1進(jìn)行該反應(yīng)之后在502 nm處有較強(qiáng)的吸收峰（曲線a）。然而，若形成磁性免疫復(fù)合物后未加入酸，那么在 400～700 nm之間就沒(méi)有特征吸收峰（曲線b）。同時(shí)，背景空白表現(xiàn)的微弱吸收峰主要是由于非特異性吸附（曲線c）。因此，以上現(xiàn)象說(shuō)明502 nm處的較強(qiáng)吸收峰主要是由于磁性免疫復(fù)合物釋放銅離子后引起的顯色反應(yīng)，基于免疫磁珠的顯色反應(yīng)可應(yīng)用于對(duì) AFB1的檢測(cè)分析。

2.2 條件優(yōu)化

圖4 溫育AFB1 (a)、納米探針(b)的時(shí)間和DPHE濃度(c)對(duì)100 ng/mL AFB1在免疫顯色反應(yīng)上吸光度的影響Fig.4 Effects of the time ofAFB1 (a) and probe (b) incubation,and the DPHE concentration of chromogenic reaction (c) on the absorbance response of 100 ng/mL AFB1

溫育時(shí)間是影響免疫分析性能的另一個(gè)重要因素。實(shí)驗(yàn)分別研究了不同溫育時(shí)間下100 ng/mL AFB1與抗體功能化的CuO NP納米探針對(duì)免疫反應(yīng)的紫外吸收響應(yīng)強(qiáng)度的影響。如圖2所示，隨著免疫反應(yīng)溫育時(shí)間的增加，紫外吸收峰的響應(yīng)強(qiáng)度不斷增大，當(dāng)溫育AFB1的時(shí)間達(dá)到15 min（圖4a）以及溫育納米探針的時(shí)間達(dá)到10 min后響應(yīng)達(dá)到一個(gè)平臺(tái)（圖4b）。該結(jié)果說(shuō)明AFB1與納米探針?lè)謩e在15 min和10 min時(shí)使免疫反應(yīng)可以達(dá)到飽和狀態(tài)。 為了保證磁性免疫復(fù)合物釋放的銅離子與顯色劑充分反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度的顯色劑對(duì)100 ng/mL AFB1夾心免疫反應(yīng)的紫外吸收響應(yīng)強(qiáng)度變化。如圖4c所示，隨著顯色劑濃度的增加，紫外吸收峰的響應(yīng)強(qiáng)度不斷增大，當(dāng)顯色劑濃度為10 μmol/L后響應(yīng)達(dá)到一個(gè)平臺(tái)。因此，本實(shí)驗(yàn)中所用的顯色劑濃度為10 μmol/L。

2.3 分析性能

圖5 a圖為不同濃度的AFB1的工作曲線，b圖為AFB1濃度對(duì)應(yīng)的顏色變化Fig.5 (a) Calibration curve of the different concentrations of AFB1; (b) Color change of the detection solution corresponding to the marked concentrations of AFB1 (ng/mL)

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)通過(guò)紫外可見(jiàn)吸收峰考查了不同濃度AFB1在該磁性免疫反應(yīng)中的響應(yīng)情況。從圖5a可以看出，502 nm處的吸收峰隨著AFB1濃度的增加而不斷增大，其吸光度與0.01～100 ng/mL AFB1的對(duì)數(shù)值成較好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=0.2998+0.1075lgC (ng/mL)，相關(guān)系數(shù)為 0.995。信噪比為3時(shí)，計(jì)算得該方法的檢測(cè)限為35 pg/mL。

2.4 特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和可靠性

為了考察該方法的特異性，實(shí)驗(yàn)分別考察了黃曲霉毒素B1、赭霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀烯酮、桔霉素和展青霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品在該免疫磁珠上的信號(hào)響應(yīng)，質(zhì)量濃度分別為2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL，經(jīng)免疫磁珠檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3次，判斷免疫磁珠的特異性，結(jié)果見(jiàn)表1，與黃曲霉毒素B1在該免疫磁珠上的靈敏信號(hào)響應(yīng)相比，赭霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀烯酮、桔霉素和展青霉毒素在該免疫磁珠上并沒(méi)有引起明顯的信號(hào)響應(yīng)，這一結(jié)果說(shuō)明非特異性真菌霉毒素在該免疫磁珠上引起的交叉反應(yīng)較小，檢測(cè)方法的特異性良好。

表1 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of Specificy experiments

將同批和不同批次的免疫磁珠分別檢測(cè) 5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)3次，結(jié)果見(jiàn)表2，檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為1.0%～2.5%，表明該檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性。將同一樣品分別放置0、0.3 h、0.5 h、0.7 h、1.0 h后測(cè)定一次，分別記錄吸光度值，結(jié)果見(jiàn)表 3。高質(zhì)量濃度黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)品(100 ng/mL)與低質(zhì)量濃度黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)品(1 ng/mL)吸光度值在1.0 h內(nèi)均變化不明顯，由此可以說(shuō)明樣品溶液在避光冷藏條件下放置2.0 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

稱取3個(gè)未知黃曲霉毒素B1含量的大米各5份進(jìn)行平行性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，3個(gè)黃曲霉毒素 B1含量不同的樣品平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜10%，結(jié)果表明該方法精密度良好。在大米樣品中添加一定含量的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，使最終質(zhì)量濃度為2 μg/kg、5 μg/kg 和10 μg/kg。經(jīng)提取回收，將高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、酶聯(lián)免疫試劑盒所得分析結(jié)果與免疫比色法分析結(jié)果相比較，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，免疫比色法回收率在99.3%～117.9%，表明將該方法用于實(shí)際樣品分析具有良好的可靠性和準(zhǔn)確度。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of repeatability experiments

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of stability experiments

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of precision experiments

3 結(jié)論

本工作發(fā)展了基于銅離子顯色反應(yīng)離子的新型免疫比色法用于檢測(cè)大米中黃曲霉毒素B1。通過(guò)在磁珠上共價(jià)固定捕獲抗體，免疫反應(yīng)后定量捕獲到免疫磁珠表面的銅納米探針，其在酸的作用下釋放出大量銅離子，銅離子與顯色劑結(jié)合后生成紅色絡(luò)合物，通過(guò)紫外-分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示：方法的最低檢測(cè)限為0.035 ng/mL，免疫比色法的標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程y=2.998+1.075lgx(ng/mL)，相關(guān)系數(shù)R=0.995；精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD為＜10%，加標(biāo)回收率在99.3%～117.9%之間，溶液在避光冷藏放置h內(nèi)穩(wěn)定，免疫比色法檢測(cè)結(jié)果與GB 5009.22-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》液相色譜法及酶聯(lián)免疫法試劑盒法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。結(jié)果表明該免疫比色法在實(shí)際應(yīng)用中具有較好的發(fā)展前景。