山葡萄UDP-葡萄糖:類(lèi)黃酮5-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（5GT）等位基因的克隆與分析

李丹丹，傅佩寧，楊宏志，朱磊，梁英

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

（2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100000）

花色苷是葡萄果皮呈現(xiàn)多種顏色的主要原因，而糖基轉(zhuǎn)移酶是生成花色苷的關(guān)鍵酶[1]。研究表明糖基轉(zhuǎn)移酶幾乎存在于所有的生物體中，直接參與低聚糖、單糖苷和聚糖苷等生物合成，目前已形成超基因家族[2]。葡萄中最常見(jiàn)的兩種糖基轉(zhuǎn)移酶是 UDP-葡萄糖:類(lèi)黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-Glucose:flavonoid-3-O-Glucosyltransferase，3GT）和 UDP-葡萄糖:類(lèi)黃酮5-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-Glucose:flavonoid-5-O-Glucosyltransferase，5GT），二者屬于 GT1家族中不同的亞家族[3]?；ㄉ卦?GT的作用下生成 3-O-單葡糖苷，而3-O-單葡糖苷在5GT作用下進(jìn)一步反應(yīng)生成3,5-O-雙葡糖苷。

葡萄中3GT的研究報(bào)道較多，而5GT報(bào)道相對(duì)較少。植物中5GT的研究最早是從花卉中開(kāi)始的，花卉植物中的 5-O-糖基化作用是使花色多樣化的重要原因。目前已在很多植物中發(fā)現(xiàn)了能催化3-O-單葡糖苷生成3,5-O-雙葡糖苷的5GT，最早發(fā)現(xiàn)于朝顏剪秋羅(Silene dioica)[4]、矮牽牛(Petunia hybrid)[5]、紫羅蘭(Matthiola incana)[6]和紫蘇(Perilla frutescens)[7]中，后續(xù)又在大麗花(Dahlia variabilis)[8]、花菖蒲(Iris ensata)[9]、荷蘭鳶尾(Iris hollandica)[10]、三花龍膽(Gentiana triflora)[11]、康乃馨(Dianthus caryophyllus)[12]和芍藥(Paeonia lactiflora)[13]等多種鮮花中發(fā)現(xiàn)。在野生馬鈴薯(Solanum Sogarandinum)[14]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[15]和茄子(Solanum melongena)[16]等植物中也發(fā)現(xiàn)了5GT。對(duì)于葡萄中雙糖苷花色苷的研究，Jánváry 等[17]在歐美雜交葡萄品種‘Regent’中克隆出 2個(gè)功能不同的5GT等位基因，分別為來(lái)自‘Chambourcin’能催化 3-O-單葡糖苷生成 3,5-O-雙葡糖苷的Cha5GT，和‘Diana’不能催化合成 3,5-O-雙葡糖苷的Dia5GT，并證實(shí)Dia5GT不能合成雙糖苷花色苷是由氨基酸突變和提前終止密碼子導(dǎo)致 C-末端的截?cái)嘣斐傻?，說(shuō)明歐亞種葡萄不能合成雙糖苷花色苷的原因是5GT等位基因由于突變而喪失5GT酶活性。但近期有報(bào)道稱在歐亞種葡萄中檢測(cè)到痕量級(jí)雙糖苷花色苷[18～20]。Yang等[19]在歐亞種葡萄中發(fā)現(xiàn)多個(gè)喪失功能的5GT等位基因。He等[21]在山葡萄‘左山一’中克隆出一個(gè)5GT基因，并通過(guò)異源表達(dá)證實(shí)其能夠催化合成3,5-O-雙葡糖苷。

山葡萄(Vitis amurensisRupr)在我國(guó)主要分布在東北三省，具有極強(qiáng)的抗寒能力。山葡萄果實(shí)成熟后呈紫黑色，具有粒小皮厚、汁少籽多、酸高糖低、單寧多、色素濃等特點(diǎn)，不宜鮮食，主要用于釀酒[22～24]。山葡萄酒是中國(guó)獨(dú)有的特殊葡萄酒種，顏色呈寶石紅，因其色澤濃郁、果香獨(dú)特和口感醇厚等特點(diǎn)而廣受消費(fèi)者喜愛(ài)[25]。但山葡萄中存在大量雙糖苷花色苷，嚴(yán)重影響葡萄酒的陳釀品質(zhì)。目前，關(guān)于山葡萄雙糖苷花色苷合成機(jī)制的研究較少，本研究選取了4種釀酒葡萄品種，分別是歐洲種‘赤霞珠’、山葡萄‘左山一’、山歐雜交品種‘哈?！汀蠹t一’為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)PCR等技術(shù)克隆5GT等位基因，分析山葡萄及山歐雜交品種中5GT等位基因的差異，為解析山葡萄及其雜交品種間糖基化花色苷組成差異的機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

‘赤霞珠’（V. viniferaL.cvCabernet Sauvignon）、‘左山 一 ’(V. amurensisRupr)、 ‘哈 桑 ’(V. vinifera,V.amurensis)、‘左紅一’(V. vinifera,V. amurensis)的葉片采集于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)北京上莊實(shí)驗(yàn)站葡萄種質(zhì)資源圃，取葡萄枝頂端第五片完全展開(kāi)的無(wú)病害幼葉，用鑷子裝進(jìn)5 mL離心管中，置于液氮罐中速凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 基因組DNA提取

取適量葡萄葉片于液氮中研磨成粉，用優(yōu)化改良的CTAB法提取高質(zhì)量葡萄基因組DNA（gDNA）[26]，用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano-drop濃度儀檢測(cè)DNA質(zhì)量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增

引用Jánváry等[17]克隆歐亞種葡萄中5GT的引物，F(xiàn)orward Primer：5’-CACTTTCCACCTGAGACACC-3’和 Reverse Primer：5’-CAGTACATCAAACGCCACTC-3’，以葡萄gDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到目的片段，PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為1455 bp。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括 35 μL ddH2O，4 μL dNTP，5 μL 10×pfu reaction buffer，正反引物各 2 μL，1.5 μL gDNA，0.5 μL pfu聚合酶。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸240 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 TA克隆與鑒定

通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小是否與預(yù)期一致，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目的片段。將純化的目的基因連接到pLB載體上，再用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH-5α中，轉(zhuǎn)化成功后挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性克隆，并隨機(jī)選取陽(yáng)性克隆送至博邁德生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5 序列分析

序列拼接利用SeqMan軟件完成；序列校準(zhǔn)、開(kāi)放閱讀框查找及氨基酸序列翻譯利用 Editseq軟件完成；多序列比對(duì)利用DNAMAN8.0軟件完成；同源性序列檢索利用 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中 BLAST程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）完成。

1.6 生物信息學(xué)分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建利用MEGA5.1軟件完成，采用Neighbor-joining法；蛋白跨膜區(qū)分析和預(yù)測(cè)利用在線軟件 THXHMM2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）完成；氨基酸序列分析利用蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù) Pfam24.0(http://pfam.sanger.ac.uk/search/sequence)完成；信號(hào)肽分析和預(yù)測(cè)利用在線軟件 SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)完成；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和分析利用在線軟件TargetP1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) 完成；預(yù)測(cè)5GT蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)利用在線軟件GOR(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?pa ge=npsa_gor4.html)，預(yù)測(cè)理化性質(zhì)等信息有在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）完成；預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維立體結(jié)構(gòu)利用在線網(wǎng)站 Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 gDNA質(zhì)量檢測(cè)

通過(guò)改良的CTAB法提取葡萄幼葉中g(shù)DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，條帶清晰完整，沒(méi)有拖尾和彌散現(xiàn)象，無(wú)蛋白污染或降解。

通過(guò) Nano-drop濃度儀測(cè)定 DNA濃度，均在1000～1300 ng/μL 范圍內(nèi)，OD260/280值在1.8～2.0 范圍，OD230/280值在2.0～2.2范圍，DNA質(zhì)量較好，無(wú)雜質(zhì)污染，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 5GT等位基因的克隆

葡萄中5GT基因沒(méi)有內(nèi)含子[19]，將NCBI上發(fā)表的‘左山一’Va5GT(KF996717.1)核苷酸序列放入葡萄基因組網(wǎng)站（http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）中 BLAST，找到黑比諾中一個(gè)位于9號(hào)染色體上的5GT基因，全長(zhǎng)1395 bp，兩條核苷酸序列比對(duì)同源性＞99%，我們確定位于9號(hào)染色體上的5GT基因組序列沒(méi)有內(nèi)含子。將測(cè)序結(jié)果拼接后與Jánváry 等[17]在歐美雜種葡萄‘Regent’中發(fā)現(xiàn)的Cha5GT和 NCBI上已發(fā)表的山葡萄Va5GT(KF996717.1)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)同源性＞99%，說(shuō)明 7個(gè)目的基因均為5GT等位基因。

2.3 序列分析

用軟件找到7個(gè)5GT等位基因的開(kāi)放閱讀框，將其翻譯成氨基酸序列，再與Cha5GT、Dia5GT（由慕尼黑大學(xué)的施瓦布教授提供）、NCBI上已發(fā)表的山葡萄Va5GT(KF996717.1)、圓葉葡萄5GT(KT327064.1)和已經(jīng)完成全基因組測(cè)序的歐亞種葡萄‘黑比諾’一起進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果如圖 1。通過(guò)葡萄基因組網(wǎng)站BLAST確定以上5GT基因均位于9號(hào)染色體上。

圖1 5GT等位基因多序列比對(duì)圖Fig.1 Multiple sequence alignment of 5GT alleles

從‘赤霞珠’中克隆出兩個(gè)5GT等位基因，命名為VvCS5GT1和VvCS5GT2。VvCS5GT1核苷酸序列全長(zhǎng)1394 bp，在歐亞種葡萄中普遍存在，由于第902位堿基缺失，導(dǎo)致其氨基酸序列從第301個(gè)氨基酸開(kāi)始移碼突變（G301#），并在第328位產(chǎn)生提前終止密碼子（E328*），造成C-末端的截?cái)?，喪失UGT家族均有的一個(gè)由44個(gè)氨基酸組成的保守序列（PSPG-box）[27～29]。而VvCS5GT2比VvCS5GT1在歐亞種葡萄中相對(duì)少見(jiàn)，只有8%的比例存在[19]。與VvCS5GT1相比，VvCS5GT2缺失第1182和1183位‘AG’兩個(gè)堿基，因此全長(zhǎng)僅1392 bp。用Editseq軟件尋找開(kāi)放閱讀框發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框完全相同，都是924 bp，編碼307個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為33.57 ku，等電點(diǎn)為4.768。與有正常5GT酶功能的Cha-5GT和Va5GT相比，VvCS5GT1和VvCS5GT2的序列特征是由于堿基缺失產(chǎn)生提前終止密碼子和移碼突變導(dǎo)致肽鏈縮短，因此推測(cè)VvCS5GT1和VvCS5GT2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均喪失5GT酶的正常功能，不能生成雙糖苷花色苷，這與Yang等[19]人和 Xing等[20]人的結(jié)論相符?！嘞贾椤械膬蓚€(gè)5GT等位基因VvCS5GT1和VvCS5GT2與其他葡萄品種5GT基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)還存在兩個(gè)氨基酸突變P78L（第78個(gè)氨基酸由P變成L）和D248Y，這也許是‘赤霞珠’5GT的品種特征性突變。

‘左山一’中得到 2個(gè)5GT等位基因，命名為VaZSY5GT1和VaZSY5GT2，二者之間有3處堿基突變，產(chǎn)生3處氨基酸差異，分別為E76D、V208A，及第703位堿基缺失導(dǎo)致VaZSY5GT2從第234個(gè)氨基酸開(kāi)始移碼突變（V236#）并產(chǎn)生提前終止密碼子(R302*)。VaZSY5GT1全長(zhǎng)為1395 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?395 bp，編碼464個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為51.48 ku，等電點(diǎn)為5.069。VaZSY5GT2全長(zhǎng)894 bp，編碼297個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量33.02 ku，等電點(diǎn)6.424。VaZSY5GT1與NCBI上發(fā)表的山葡萄‘左山一’Va5GT同源性高達(dá)99.93%，核苷酸序列只有一個(gè)堿基差異，即氨基酸差異R412K，與Cha5GT序列同源性高達(dá)99.71%，只有4個(gè)堿基差異，氨基酸變化為D76E、A208V、A259S、L372M，推測(cè)VaZSY5GT1有5GT酶功能，而VaZSY5GT2因移碼突變和C-末端截?cái)鄦适Т嗣腹δ堋?/p>

‘哈桑’中得到 2個(gè)5GT等位基因，命名為Vv×VaHS5GT1和Vv×VaHS5GT2，兩者之間共有 16處堿基差異，是四種葡萄中內(nèi)部差異最大的品種。其中5處是無(wú)義突變，所以存在11處氨基酸差異。非保守區(qū)氨基酸突變有I93M、S103G、K187N、Y262C、S283P、ENEE316-319·、T383P、E389K、A395G、R422G，保守區(qū)氨基酸突變僅有 E343D。Vv×VaHS5GT1核苷酸序列全長(zhǎng)為1395 bp，開(kāi)放閱讀框也為1395 bp，編碼464個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為51.66 ku，等電點(diǎn)為4.976；Vv×VaHS5GT2全長(zhǎng)為1383bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?383 bp，編碼460個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為50.95 ku，等電點(diǎn)為5.093。將Vv×VaHS5GT1與其他5GT比對(duì)發(fā)現(xiàn)幾處錯(cuò)義突變M93I、G113W、N187K、I282M、K318E、K389E、G422R，沒(méi)有堿基缺失、移碼突變和提前終止密碼子；而將Vv×VaHS5GT2與其他5GT比對(duì)發(fā)現(xiàn)不僅有錯(cuò)義突變S103G、G113W、Y262C、I282M、S283P、E343D、T383P，還有因缺失 12個(gè)堿基導(dǎo)致的框內(nèi)缺失突變ENKE316-319·，其中S103G、S283P、ENKE316-319·、T383P四處氨基酸突變?cè)谔鸲咸眩╒. cinerea）中也存在，而且甜冬葡萄中雙糖苷花色苷含量＜15%[18,28～30]，‘哈?！须p糖苷花色苷占總花色苷含量的10%[31]。Vv×VaHS5GT1被推測(cè)可以正常發(fā)揮5GT酶功能，Vv×VaHS5GT2由于氨基酸缺失、錯(cuò)義突變則可能喪失5GT酶正常功能。G113W、I282M突變?cè)赩v×VaHS5GT1和Vv×VaHS5GT2中均有出現(xiàn)，且只存在于‘哈?！?，可推測(cè)‘哈?！?GT品種特征性突變。

‘左紅一’中克隆出兩個(gè)5GT等位基因，其中一個(gè)命名為Vv×VaZHY5GT，另一個(gè)5GT基因經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)和‘左山一’中VaZSY5GT2核苷酸序列完全相同，即‘左紅一’與‘左山一’擁有一個(gè)共同的5GT基因VaZSY5GT2。Vv×VaZHY5GT全長(zhǎng)1395 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?395 bp，編碼464個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為51.43 ku，等電點(diǎn)為 5.069；Vv×VaZHY5GT與VaZSY5GT1只有一個(gè)堿基差異T1195A，氨基酸變化為L(zhǎng)399M。將Vv×VaZHY5GT與有功能的Va5GT和Cha5GT序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)同源性＞99%，且沒(méi)有提前終止密碼子或移碼突變，只有幾個(gè)位于非保守區(qū)的錯(cuò)義突變，而‘左紅一’中雙糖苷花色苷占總花色苷含量的31%[31]，因此推測(cè)Vv×VaZHY5GT可以催化合成雙糖苷花色苷。

將所得5GT基因序列在葡萄基因組網(wǎng)站（http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）中BLAST，找到‘黑比諾’5GT基因，全長(zhǎng)1395 bp，與Va5GT和Cha5GT的堿基序列同源性＞99%，開(kāi)放閱讀框?yàn)?203 bp，編碼400個(gè)氨基酸，從第396個(gè)氨基酸開(kāi)始移碼突變并存在提前終止密碼子，因此推測(cè)‘黑比諾’5GT基因沒(méi)有功能。NCBI上發(fā)表的圓葉葡萄5GT基因部分核苷酸序列長(zhǎng)1394 bp，部分蛋白質(zhì)序列由464個(gè)氨基酸組成。與其他5GT基因序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)圓葉葡萄5GT沒(méi)有終止密碼子，但序列同源性較高，只有三個(gè)圓葉葡萄品種特征性等位變異N20K、S286T和Q462L。除此之外，圓葉葡萄5GT與Cha5GT有2處等位變異D76E和A208V，但是這兩個(gè)氨基酸位置保守性非常低，Vv×VaZHY5GT、VaZSY5GT1、Va5GT和圓葉葡萄5GT的第76個(gè)和第208個(gè)氨基酸為谷氨酸（E）和纈氨酸（V），而在VvCS5GT1、VvCS5GT2、VaZSY5GT2、Vv×VaHS5GT1、Vv×VaHS5GT2、‘黑比諾’5GT、Cha5GT和Dia5GT中為天冬氨酸（D）和丙氨酸（A），可見(jiàn)這兩個(gè)氨基酸位置不影響5GT酶的功能。此外，圓葉葡萄中只存在雙糖苷花色苷[31]，因此推測(cè)圓葉葡萄5GT有功能。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

圖2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree

將所得5GT序列VvCS5GT1、VvCS5GT2、VaZSY5GT1、VaZSY5GT2、Vv×VaHS5GT1、Vv×VaHS5GT2、Vv×VaZHY5GT置于 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLASTP，找到其他葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)序列，用MEGA5.1軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖2。

在NCBI中搜索與花色苷生物合成有關(guān)的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，將其與本研究克隆的7個(gè)5GT序列比對(duì)并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。如圖2所示，進(jìn)化樹(shù)根據(jù)區(qū)域選擇性分成三簇，根據(jù)每簇的基因組成判斷三個(gè)簇為UGT家族中的三個(gè)亞家族，分別為3GT亞家族，7GT亞家族和5GT亞家族。從‘赤霞珠’、‘哈?！?、‘左紅一’和‘左山一’中克隆出的7個(gè)5GT基因全部位于5GT亞家族，而且被推測(cè)在葡萄中不能合成雙糖苷花色苷的無(wú)功能5GT基因除Vv×VaHS5GT2外全部聚集在橫線下方，特點(diǎn)是均存在移碼突變和提前終止密碼子，而有功能的5GT基因則聚集在橫線上方，聚集緊密說(shuō)明遺傳距離較近。

Vv×VaHS5GT2雖然被推測(cè)為無(wú)功能5GT基因，但其與Vv×VaHS5GT1序列同源性最高，且沒(méi)有移碼突變或提前終止密碼子，故與劃分在橫線上方的Vv×VaHS5GT1遺傳距離較近。

2.5 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

通過(guò) THXHMM2.0在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）對(duì)7個(gè)5GT等位基因進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)分析和預(yù)測(cè)，結(jié)果表明均不存在跨膜區(qū)，不屬于膜結(jié)合蛋白。用 Pfam24.0在線網(wǎng)站(http://pfam.sanger.ac.uk/search/sequence)分析蛋白質(zhì)，結(jié)果表明7個(gè)5GT均屬于GT1家族，GT-B型折疊。用 SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)和分析以上7個(gè)5GT蛋白信號(hào)肽，結(jié)果表明均不屬于膜結(jié)合蛋白，無(wú)信號(hào)肽，非分泌蛋白。通過(guò)TargetP1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) 對(duì)5GT蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果如表1，說(shuō)明5GT均存在于細(xì)胞中除線粒體、葉綠體外的其他部位，且再次驗(yàn)證不存在信號(hào)肽。

表1 亞細(xì)胞定位分析表Table 1 Subcellular localization analysis

2.6 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò) GOR 網(wǎng)站(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預(yù)測(cè) 5GT蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：VvCS5GT1中α-螺旋占37.46%，延伸鏈占14.98%，無(wú)規(guī)則卷曲占47.56%；VvCS5GT2中α-螺旋占37.46%，延伸鏈占14.98%，無(wú)規(guī)則卷曲占 47.56%；VaZSY5GT1中α-螺旋占33.62%，延伸鏈占20.47%，無(wú)規(guī)則卷曲占45.91%；VaZSY5GT2中α-螺旋占36.53%，延伸鏈占21.60%，無(wú)規(guī)則卷曲占 41.87%；Vv×VaHS5GT1中α-螺旋占38.15%，延伸鏈占17.89%，無(wú)規(guī)則卷曲占43.97%；Vv×VaHS5GT2中α-螺旋占33.70%，延伸鏈占19.78%，無(wú)規(guī)則卷曲占 46.52%；Vv×VaZHY5GT中α-螺旋占34.70%，延伸鏈占19.83%，無(wú)規(guī)則卷曲占45.47%。

圖3 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.3 Tertiary structure prediction

用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)5GT蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，結(jié)果如表2。肽鏈相對(duì)完整的Vv×VaHS5GT1、Vv×VaHS5GT2、Vv×VaZHY5GT和VaZSY5GT1消光系數(shù)較大，而由于提前終止密碼子而截?cái)嗟腣vCS5GT1、VvCS5GT2、VaZSY5GT2消光系數(shù)相對(duì)較小，說(shuō)明肽鏈縮短對(duì)消光系數(shù)有一定影響。7個(gè)5GT等位基因的體外半衰期均達(dá)到30 h，不穩(wěn)定系數(shù)均＞40，因此均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。親水性數(shù)值越低蛋白質(zhì)親水性越強(qiáng)，數(shù)值越高疏水性越強(qiáng)，VaZSY5GT2為疏水性蛋白，其余5GT均有一定親水性。用 Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/）預(yù)測(cè)5GT蛋白質(zhì)三維立體結(jié)構(gòu)，如圖 3所示，VvCS5GT1和VvCS5GT2擁有相同三級(jí)結(jié)構(gòu)，前面被推測(cè)為有5GT酶功能的Vv×VaHS5GT1、Vv×VaZHY5GT和VaZSY5GT1蛋白結(jié)構(gòu)折疊緊密且相對(duì)完整，而被推測(cè)為無(wú)5GT酶功能的VvCS5GT1、VvCS5GT2、VaZSY5GT2結(jié)構(gòu)均松散且不完整。雖然Vv×VaHS5GT2蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，但與Vv×VaHS5GT1相比可以看出部分蛋白結(jié)構(gòu)缺失。

表2 5GT蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)Table 2 Prediction of physicochemical properties of 5GT protein

3 討論

葡萄中糖基化花色苷包括單糖苷花色苷和雙糖苷花色苷，在不同葡萄品種中糖基化花色苷的組成差異明顯，如山葡萄‘左山一’、山歐雜種葡萄‘左紅一’和‘哈?！须p糖苷花色苷分別占總花色苷含量的82%、31%和10%[31]，而決定葡萄糖基化花色苷組成的重要原因是雙糖苷花色苷的關(guān)鍵酶基因5GT的基因型。因此，本研究選擇‘左山一’、‘左紅一’和‘哈?！@3個(gè)山葡萄/山歐雜交品種和 1個(gè)歐亞種葡萄‘赤霞珠’作為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)基因克隆等技術(shù)得到5GT等位基因的核苷酸序列，探究5GT等位基因的核苷酸突變情況和氨基酸組成差異，并利用生物信息學(xué)軟件對(duì)5GT等位基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測(cè)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，四種葡萄樣品共送樣測(cè)序近100個(gè)單克隆，此外還有PCR產(chǎn)物直接測(cè)序以及分段測(cè)序多個(gè)樣品，而且實(shí)驗(yàn)期間換過(guò)高保真聚合酶、DNA模板、引物和測(cè)序公司等實(shí)驗(yàn)條件以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Yang等[19]人在8個(gè)葡萄種中共發(fā)現(xiàn)54個(gè)5GT等位基因，并按照突變特點(diǎn)分類(lèi)。其中36個(gè)不存在移碼突變或提前終止密碼子的5GT屬于W型，可能有5GT酶功能，剩余18個(gè)5GT基因由于移碼突變或提前終止密碼子可能喪失5GT酶活性，根據(jù)移碼突變或終止密碼子的位置分成A～G七種類(lèi)型。Yang等[19]人發(fā)現(xiàn)的54個(gè)5GT等位基因中有6個(gè)與本研究結(jié)果一致，VvCS5GT1與Yang等[19]人發(fā)現(xiàn)的5GT基因型A1一致，VvCS5GT2與A2一致，A1和A2只存在于歐亞種野生型（V. viniferassp.sylvestris）葡萄和歐亞種栽培品種（V.viniferassp.vinifera）中，A型5GT基因的突變特征是從第301個(gè)氨基酸開(kāi)始移碼突變（G301#）。VaZSY5GT2與B1一致，B1不僅存在于歐亞種葡萄（V.vinifera）中，還在一些雜交品種中出現(xiàn)，B型突變特征是從第 234個(gè)氨基酸開(kāi)始移碼突變（V236#）。VaZSY5GT1與 W5一致，W5來(lái)自山葡萄（V.amurensis），Vv×VaHS5GT2與W23一致，W23來(lái)自甜冬葡萄（V. cinerea），Vv×VaHS5GT1與W19一致，而 W19在甜冬葡萄（V. cinerea）、美洲葡萄（V.labrusca）、夏葡萄（V. aestivalis）以及一些雜交葡萄品種中均有出現(xiàn)。只有Vv×VaZHY5GT不存在于Yang等[19]發(fā)現(xiàn)的54個(gè)5GT等位基因中，但與W5相似性最高，只有一個(gè)堿基差異 A1195T，相應(yīng)的氨基酸變化為M399L，可能是一個(gè)未被發(fā)現(xiàn)的新5GT基因型。He等[21]在‘左山一’中克隆出一個(gè)Va5GT，通過(guò)研究其表達(dá)及生化特征證實(shí)其有5GT酶活性，可以合成雙糖苷花色苷。而本研究從‘左山一’中克隆的VaZSY5GT1與Va5GT比對(duì)后發(fā)現(xiàn)有一個(gè)堿基差異G1235A，即氨基酸差異R412K了，但在Yang等人[19]報(bào)道的54個(gè)5GT等位基因中并未找到與Va5GT完全相同的基因型，Va5GT可能也是一個(gè)新的5GT等位基因。

雖然基因突變的隨機(jī)性很大，但也能發(fā)現(xiàn)一些突變規(guī)律，如Vv×VaHS5GT2和甜冬葡萄都在堿基位置947-958缺失12個(gè)堿基，造成連續(xù)四個(gè)氨基酸框內(nèi)缺失（ENKE316-319·），Vv×VaHS5GT1和夏葡萄（V.aestivalis）在該區(qū)域存在共同的氨基酸突變 K318E，說(shuō)明該區(qū)域是突變熱點(diǎn)區(qū)，氨基酸的組成和數(shù)量都是可變的[19]。另一個(gè)突變規(guī)律是第 76位氨基酸存在三種突變形式，D76E出現(xiàn)在山葡萄和圓葉葡萄中，D76N出現(xiàn)在歐亞種葡萄中，D76Y也出現(xiàn)在圓葉葡萄中[19]。

以被證實(shí)有功能的5GT-Cha為參照序列，根據(jù)突變特征，將5GT等位基因分成三種類(lèi)型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型5GT等位基因的突變特征是存在提前終止密碼子和移碼突變，包括VvCS5GT1、VvCS5GT2、VaZSY5GT2、Dia5GT和 ‘黑 比 諾 ’5GT； 而Vv×VaHS5GT2屬于Ⅱ型突變，特征是框內(nèi)缺失突變，無(wú)移碼突變或提前終止密碼子；Ⅲ型突變特征是僅發(fā)生氨基酸置換，包括Vv×VaHS5GT2、Vv×VaZHY5GT、VaZSY5GT1、Va5GT和圓葉葡萄5GT。顯然，Ⅰ型和Ⅱ型突變都可能使5GT酶失去活性，而Ⅲ型突變則不會(huì)影響5GT酶活性。這與前面序列分析的結(jié)果相符，與Yang等人[19]的結(jié)果也一致。

VvCS5GT1、VvCS5GT2、VaZSY5GT2中發(fā)生肽鏈截?cái)啵虼送茰y(cè)其編碼的蛋白質(zhì)不能正常發(fā)揮5GT酶功能，從而使葡萄中的雙糖苷花色苷含量降低?！嘞贾椤?2個(gè)5GT基因均沒(méi)有功能，這也許是‘赤霞珠’中幾乎不含有雙糖苷花色苷的原因，因此純歐亞種葡萄釀造的葡萄酒陳年潛力更好?！！?、‘左紅一’和‘左山一’中均含有一個(gè)功能性5GT等位基因，但雙糖苷花色苷占比卻有明顯差異，有一種可能性是其他染色體上也存在5GT等位基因，說(shuō)明位于9號(hào)染色體上的5GT等位基因還不足以解釋山葡萄及其雜交品種中花色苷的組成差異。還有一種可能是基因序列差異導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的酶功能和活性不同，使雙糖苷花色苷合成量不同。Xing等[20]人在歐亞種葡萄（V. vinifera）‘赤霞珠’中發(fā)現(xiàn)5個(gè)5GT候選基因Vv5GT1、Vv5GT2、Vv5GT3、Vv5GT4、Vv5GT5，其中Vv5GT1就是本研究中的VvCS5GT1和Yang等人[19]報(bào)道的A1，其余四個(gè)基因經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)Vv5GT2位于 17號(hào)染色體，而Vv5GT3、Vv5GT4和Vv5GT5則位于5號(hào)染色體。Hall等人[33]在美洲種葡萄(V. labrusca)中發(fā)現(xiàn)的四個(gè)類(lèi)似5GT基因OGT1、OGT2、OGT3、OGT4經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)位于5號(hào)染色體上。因此，繼續(xù)在其他染色體上尋找更多的5GT等位基因并且驗(yàn)證基因功能，是我們下一步研究的重要內(nèi)容，為探究不同山葡萄品種間糖基化花色苷組成差異的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從‘赤霞珠’、‘左山一’、‘哈?！?、‘左紅一’4 個(gè)葡萄品種中共克隆出7個(gè)等位基因，均位于9號(hào)染色體上。‘左紅一’和‘左山一’中有一個(gè)相同的5GT等位基因。經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)VvCS5GT1、VvCS5GT2、Vv×VaHS5GT2、VaZSY5GT2中存在氨基酸缺失、移碼突變或提前終止密碼子，因此推測(cè)這4個(gè)5GT等位基因失去5GT酶活性，不能合成雙糖苷花色苷；而Vv×VaHS5GT1、Vv×VaZHY5GT、VaZSY5GT1僅有基礎(chǔ)氨基酸置換，與有功能的Cha5GT一致性＞99%，因此推測(cè)這三個(gè)序列可以合成雙糖苷花色苷。