艾灸益氣活血法對D-半乳糖致衰老大鼠免疫功能的影響

李霞，唐中生

(1.貴陽護(hù)理職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)護(hù)理教研室；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025)

衰老是指隨著年齡增加，生物機(jī)體的細(xì)胞、組織和器官普遍逐漸出現(xiàn)退行性變化的一個過程。研究表明，衰老不僅會增加機(jī)體患病幾率，也可造成器官功能衰竭，甚至死亡，應(yīng)明確將衰老看成一類疾病[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎、脾虛是衰老發(fā)生的機(jī)制，而免疫衰老學(xué)說受到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的普遍認(rèn)同[2-3]。艾灸是將艾條點燃以灸灼穴位皮膚的一種傳統(tǒng)療法，是針灸學(xué)的重要組成部分?！鹅`樞·官能》曰“針?biāo)患?，灸之所宜”；《醫(yī)學(xué)入門·針灸》載“藥之不及，針之不到，必須灸之”，說明灸法有其獨特的治療優(yōu)勢，在健康狀態(tài)下可以增強(qiáng)免疫力，在疾病狀態(tài)下則可抑制異常免疫反應(yīng)[4]。延緩衰老是人類永恒的目的，如何控制或者延緩衰老，尋找抗衰老的生物學(xué)標(biāo)志，已成為國內(nèi)外研究的熱點?；谂R床抗衰老的有效性，本實驗研究了艾灸抗衰老的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量280～300 g，清潔級，由重慶滕鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，許可證號：SCXK(軍)2012-0011。

1.1.2藥物與試劑吡拉西坦(產(chǎn)品批號：2160911)；艾條(貴陽市醫(yī)藥公司)；血清TGF-β、IFN-γ檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.3儀器電子天平：瑞士梅特勒公司；低速大容量離心機(jī)(4 000轉(zhuǎn)/分)：長沙平凡儀器儀表有限公司；722S分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；自動酶標(biāo)讀數(shù)儀：美國BioTek公司。

1.2方法

1.2.1造模及分組大鼠每日定時背部皮下注射10 mg/mL的D-半乳糖溶液100 mg/kg[5]，連續(xù)30 d，制備衰老大鼠模型。模型制作成功后，隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、艾灸組、吡拉西坦組，另設(shè)空白組作為對照，每組10只。

1.2.2穴位及定位取百會、膈俞(雙)、氣海、三陰交(雙)、膻中穴，參考《實驗針灸學(xué)》[6]常用動物穴位定位法及擬人對照法定位。

1.2.3治療方法

1.2.3.1艾灸組將大鼠穴區(qū)剃毛，按順序持艾條于穴位上方0.5 cm 處溫和灸(以大鼠相對安靜，無劇烈掙扎、嘶叫為度)，每次5 min，隔日1次，共灸15次[7]，灸時室內(nèi)無風(fēng)。經(jīng)預(yù)實驗皮溫測試，艾灸3 min 達(dá)到最高溫度約44 ℃，之后維持在43.5 ℃左右。隔日1次，連續(xù)15次。

1.2.3.2吡拉西坦組隔日1次，給予10 mg·kg-1吡拉西坦灌胃，連續(xù)15次。

1.2.3.3正常組和模型組隔日1次，給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)15次。

1.2.4指標(biāo)檢測

1.2.4.1胸腺、脾臟指數(shù)大鼠稱重，脫臼處死，剖腹取胸腺和脾臟稱重，計算指數(shù)。

1.2.4.2淋巴細(xì)胞增殖活性無菌制備大鼠脾細(xì)胞懸液，RPMI1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×107·mL-1。每組設(shè)實驗孔和對照孔，取100 μL脾細(xì)胞懸液加入96孔板，實驗孔加入100 μL含ConA(T 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng))或LPS(B 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng))的RPMI1640 培養(yǎng)液，使終濃度為5 μg·mL-1，對照孔只加等量的RPMI1640 培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，吸棄上清50 μL，加入MTT 溶液50 μL(終濃度為0.5 mg·mL-1)，振蕩1 min，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸棄上清，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩30 s，酶標(biāo)儀于490 nm 波長處讀取吸光值(A)，并計算刺激指數(shù)SI，SI=(實驗孔A-對照孔A)/對照孔A。

1.2.4.3血清TGF-β和IFN-γ含量于腹股溝處切開皮膚，剪斷股動脈采集血液，靜置過夜后取血清，ELISA 法測定。

2　結(jié)　　果

2.1大鼠一般狀態(tài)空白組大鼠精神狀態(tài)良好。模型組大鼠明顯消廋、體重下降、體毛干枯；嗜臥、倦??；食欲明顯下降，大便溏瀉，肛周有污物。艾灸組和吡拉西坦組一般狀態(tài)基本如常，但毛色較暗，反應(yīng)遲緩，攝食尚可。

2.2各組大鼠脾臟、胸腺指數(shù)的變化

與空白組比較，模型組大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯降低(P<0.01)，與模型組比較，艾灸組和吡拉西坦組大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯升高(P<0.01)，表明艾灸可通過增強(qiáng)衰老大鼠的脾臟、胸腺指數(shù)，發(fā)揮其延緩衰老的作用(見表1)。

表1　各組大鼠胸腺和脾臟指數(shù)的變化

2.3各組大鼠淋巴細(xì)胞增殖的變化

與空白組比較，模型組脾T、B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，艾灸組與吡拉西坦組脾T、B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均顯著升(P<0.01)，表明艾灸可通過促進(jìn)衰老大鼠脾T、B淋巴細(xì)胞增殖，發(fā)揮其延緩衰老的作用(見表2)。

表2　各組大鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)(SI)的變化

2.4各組大鼠TGF-β和IFN-γ含量的變化

與空白組比較，模型組TGF-β含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，艾灸組TGF-β含量明顯降低(P<0.05)。與空白組比較，模型組IFN-γ含量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，艾灸組IFN-γ含量顯著升高(P<0.01)。表明艾灸可通過降低大鼠TGF-β含量、提升大鼠IFN-γ含量，發(fā)揮其延緩衰老的作用(見表3)。

表3　各組大鼠TGF-β和IFN-γ含量的變化

3　討　　論

衰老，乃是指機(jī)體各器官功能普遍的、逐漸降低的過程。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論中，免疫學(xué)理論與衰老關(guān)系密切。機(jī)體衰老過程中，胸腺逐漸萎縮，胸腺細(xì)胞的發(fā)育變得遲緩，T細(xì)胞的活化受限，對抗原刺激的反應(yīng)性減弱，導(dǎo)致抑制性細(xì)胞因子增多，對細(xì)胞具有活化作用的細(xì)胞因子的含量減少，從而影響機(jī)體的B細(xì)胞活化和體液免疫功能，使得免疫功能出現(xiàn)生理性衰退，發(fā)展到一定程度時，機(jī)體出現(xiàn)病理性衰老。

根據(jù)衰老代謝紊亂學(xué)說，長期過量攝入D-半乳糖可使動物體內(nèi)糖代謝紊亂，最終會引起機(jī)體內(nèi)重要器官代謝異常，導(dǎo)致衰老。D-半乳糖造成的亞急性衰老模型是公認(rèn)的衰老模型之一。本實驗成功制備了亞急性衰老大鼠，檢測發(fā)現(xiàn)其脾臟、胸腺指數(shù)明顯降低，T、B淋巴細(xì)胞增殖活性下降，TGF-β升高和IFN-γ下降。

艾灸療法具有溫通氣血、扶病祛邪和防病保健等功效?！夺t(yī)學(xué)帛書》中就提出“灸則強(qiáng)食產(chǎn)肉”。《扁鵲心書》曰“保命之法，灼灸第一，人于無病時常灸關(guān)元、氣海、命門、中脘，雖未得長生，亦可保百余年壽矣”?！额惤?jīng)圖翼》：“神闕行隔鹽灸，艾灸至三五百壯，不惟疾愈，亦且延年”。艾灸不僅益壽延年，還可無病先防，有病早治。

中醫(yī)理論認(rèn)為，人體的生長、發(fā)育、衰老與臟腑功能和經(jīng)絡(luò)氣血的盛衰關(guān)系密切。當(dāng)機(jī)體氣血不足，經(jīng)絡(luò)之氣運行不暢，臟腑功能減退，陰陽失去平衡，均會導(dǎo)致和加快衰老。氣行則血行，血行則髓生，氣血調(diào)和，百病不生。衰老多屬本虛標(biāo)實，氣滯血瘀。本研究選取百會、膈俞(雙)、氣海、三陰交(雙)、膻中組成益氣活血方。百會穴屬督脈，可開竅醒神、回陽固脫，膈俞穴開胸通膈，氣海穴培補(bǔ)元氣，三陰交穴健脾益氣，調(diào)補(bǔ)肝腎，膻中穴可理肺氣、通乳絡(luò)，共奏益氣活血之功。針灸益氣活血法可明顯降低血管性癡呆(VD)大鼠海馬真性膽堿酯酶(T-chE)含量[8]，提高VD大鼠大腦皮質(zhì)CA1區(qū)突觸數(shù)密度、突觸活性區(qū)的面積密度[9]和海馬組織超氧化物歧化酶(SOD)活性及降低丙二醛(MDA)含量[10]。

基于艾灸的抗衰老和益氣活血法理論，我們以艾灸為治療方法，選取百會、膈俞(雙)、氣海、三陰交(雙)、膻中為施治穴位，以衰老大鼠作為研究對象，研究了艾灸對亞急性衰老大鼠免疫功能的變化。結(jié)果表明，艾灸后衰老大鼠胸腺、脾臟指數(shù)明顯提高，T、B淋巴細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，TGF-β含量降低，而IFN-γ含量升高。因此初步認(rèn)為，艾灸可通過增強(qiáng)衰老大鼠免疫功能，達(dá)到延緩衰老的目的。