UHPLC-Q-TOF/MS分析美洲凌霄花與秋鼠曲草的化學(xué)成分△

李　融　韓海燕， 2　孫　群　張　健*

(1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇　蘇州　215123；　2.鶴壁市人民醫(yī)院，河南　鶴壁　458000)

美洲凌霄花為紫葳科凌霄屬植物美洲凌霄Campsis radicans (L.) Seem.的干燥花，性味甘、酸、寒，歸肝、心包經(jīng)，有涼血、化淤、祛風(fēng)之功效，主治血滯經(jīng)閉、痛經(jīng)、崩中漏下、血熱風(fēng)癢等，江蘇、上海、湖南等地有栽培[1]。中國(guó)有凌霄屬2種植物，分別為凌霄 (Campsis grandiflora (Thunb.) K. Schum.) 和美洲凌霄 (Campsis radicans (L.) Seem.)[1]。2015版藥典收錄的中藥凌霄花即為紫葳科植物凌霄或美洲凌霄的干燥花[2]。對(duì)凌霄花的化學(xué)成分及其藥理活性研究較多[3]，但對(duì)于美洲凌霄花的化學(xué)成分研究較少。本課題組曾對(duì)美洲凌霄花進(jìn)行了化學(xué)研究，分離得到鼠李檸檬素等[4]。秋鼠曲草Gnaphalium hypoleucum D. C.為菊科鼠曲草屬植物，廣泛分布于云南各地，也稱鼠曲草、清明菜等，可作為野菜食用，民間醫(yī)認(rèn)為有止咳化痰、祛風(fēng)除濕、解毒之功效，用于治療傷風(fēng)感冒，咳嗽多痰，風(fēng)濕痛等[5]。該屬植物中主要含有黃酮類和二萜類成分[6]。本課題組對(duì)秋鼠曲草進(jìn)行了化學(xué)研究，分離得到5-羥基-3， 6， 7， 8-四甲氧基黃酮、木犀草素-4’-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-4’-O-β-D-葡糖糖苷等[7]。在此基礎(chǔ)上，本課題組采用UHPLC-Q-TOF/MS法，對(duì)秋鼠曲草與美洲凌霄花進(jìn)一步化學(xué)成分分析。

1　儀器與試藥

1.1儀器ACQUITY UPLC/Q-TOF MS系統(tǒng) (Waters公司，美國(guó)) ，采用電噴霧電離 (ESI)，二元高壓泵，在線脫氣裝置，自動(dòng)進(jìn)樣器，數(shù)據(jù)采集與處理采用MassHunter軟件；UPLC C18分析柱 (2.1 mm×100 mm， 1.7 μm， ACQUITY UPLC BEH， Waters， USA)；數(shù)據(jù)采集與處理采用MassHunter 軟件。

1.2試藥美洲凌霄藥材購(gòu)自江蘇省連云港，經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院陸葉老師鑒定為美洲凌霄Campsis radicans (L.) Seem.的干燥花。秋鼠曲草購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院陸葉老師鑒定為秋鼠曲草Gnaphalium hypoleucum D. C.地上部分。自制鐵冬青酸、薔薇酸、委陵菜酸、常春藤皂苷元、山楂酸、科羅索酸、19α-羥基熊果酸、齊墩果酸、熊果酸、熊果醇為美洲凌霄的對(duì)照品，純度為95%，自制芹菜素、木犀草素、5， 7-二羥基-3， 8， 4’-三甲氧基黃酮、luteolin-4’-O-β-D-glucoside為秋鼠曲草的對(duì)照品，純度為95%，所有試劑均為色譜純 (E. Merck， Darmstadt， Germany)，水為超純水系統(tǒng)制備得到 (Millipore， Bedford， MA， USA)。

2　方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品與樣品溶液制備分別稱取鐵冬青酸、薔薇酸、委陵菜酸、常春藤皂苷元、山楂酸、科羅索酸、19α-羥基熊果酸、齊墩果酸、熊果酸、熊果醇適量，加入甲醇配成1.00 mg·mL-1對(duì)照品溶液。分別稱取芹菜素、木犀草素、5， 7-二羥基-3， 8， 4’-三甲氧基黃酮、luteolin-4’-O-β-D-glucoside，加入甲醇配成1.00 mg·mL-1對(duì)照品溶液。美洲凌霄花10g，100mL甲醇回流提取兩次，回收溶劑得美洲凌霄花提取物，稱取美洲凌霄花甲醇提取物適量，加入甲醇配成2.00 mg·mL-1樣品溶液。秋鼠曲草20g，400mL90%乙醇回流提取2次，回收溶劑得秋鼠曲草提取物，稱取秋鼠曲草乙醇提取物適量，加入甲醇配成2.00 mg·mL-1樣品溶液。

2.2UHPLC-Q-TOF/MS條件美洲凌霄花化學(xué)分析的色譜條件：流動(dòng)相A相為含有0.1%的甲酸的水，B相為含有0.1%甲酸的乙腈；流速為0.4 mL·min-1；梯度洗脫，0 ～ 10 min A:B (95:5 ～ 90:10)，10～25 min A:B (90:10 ～65:35)，25 ～32 min A:B (65:35 ～ 15:85)，32 ～ 35 min (15:85 ～ 0:100)；進(jìn)樣量為1μL；掃描波長(zhǎng)為190～400 nm。

秋鼠曲草化學(xué)分析的色譜條件：流動(dòng)相A相為含有0.1%的甲酸的水，B相為含有0.1%甲酸的乙腈；流速為0.4 mL·min-1；梯度洗脫，0 ～ 8 min A:B (95:5～75:25)，8 ～18 min A:B (75:25-25:75)，18～25 min A:B (25:75～0:100)，25～28 min (0:100)，28～31 min (0:100～95:5)；進(jìn)樣量為1μL；掃描波長(zhǎng)為190～400 nm。

質(zhì)譜條件：Agilent 6540 accurate mass Q-TOF LC/MS (Agilent Technologies， USA) 系統(tǒng)，配有電噴霧離子源 (正離子模式) 和MassHunter 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，霧化氣溫度為300 ℃，霧化氣體積流量8.0 L·min，脫溶劑氣 (N《》2)體積流量8.0 L·min-1， 毛細(xì)管電壓為3500 V (正離子模式)，噴嘴電壓為500 V，掃描范圍 m/z 100～1700。

2.3UHPLC-Q-TOF/MS分析與平衡比較，對(duì)比所加對(duì)照品的基峰離子流圖 (base peak chromatogram， BPC)，分析各個(gè)對(duì)照品的保留時(shí)間及主要質(zhì)譜信號(hào)，并列出其分子離子峰(圖1、2，表1)。參照對(duì)照品的保留時(shí)間及質(zhì)譜信號(hào)，從美洲凌霄花甲醇提取物中鑒定出20個(gè)化合物，其中化合物3-O-β-D-glucopyranosylerythrodiol、3-hydroxyolean-12-en-28-O-β-D-glucopyranoside、6β-hydroxymaslinic acid、2 α， 3 α， 19 α， 23-tetraydroxy-urs-12-en-28-oic acid在凌霄屬中未見報(bào)道(表1)。

參照對(duì)照品基峰離子流圖的保留時(shí)間及質(zhì)譜信號(hào)，從秋鼠曲草醇提取物中鑒定出19個(gè)化合物，主要為黃酮類化合物(圖3、4，表2)。

表1　美洲凌霄花甲醇提取物的UHPLC-Q-TOF/MS分析

編號(hào)保留時(shí)間(min)化合物名稱分子式[M+H]+/[M]+吸收波長(zhǎng)113.12阿江欖仁樹葡萄糖苷ⅡC36H58O10651.2818[M+H]+223213.48campsisideC25H30O11506.1803[M]+219,300315.59campneosideⅡC29H36O16640.2236[M]+200,220,290,330416.30ActeosideC29H36O15625.2117[M+H]+220,330516.66leucoscep-tosideAC30H38O15638.2875[M]+200,220,290,330617.28campneosideⅠC30H38O16654.2377[M]+220,320821.423-O-β-D-glu-copyranosyl-erythrodiolC36H60O7605.2609[M+H]+220921.763-hydroxyolean-12-en-28-O-β-D-glucopy-ranosideC36H60O7605.2406[M+H]+2201023.946β-hydroxy-maslinic acidC30H48O6504.3070[M]+2231124.452α,3α,19α,23-tetraydroxy-urs-12-en-28-oic acidC30H48O6504.2395[M]+2201224.62myrianthicacidC30H48O6504.2571[M]+2231327.73鐵冬青酸C30H48O5489.3478[M+H]+2201427.85薔薇酸C30H48O5489.3347[M+H]+2241527.94委陵菜酸C30H48O5489.3347[M+H]+2231628.26常春藤皂苷元C30H48O4473.3456[M+H]+2231729.16山楂酸C30H48O4473.3511[M+H]+2231829.22科羅索酸C30H48O4473.2861[M+H]+2241929.2819α-羥基熊果酸C30H48O4473.2812[M+H]+2232030.30齊墩果酸C30H48O3457.2923[M+H]+2222130.34熊果酸C30H48O3457.2939[M+H]+224

表2　秋鼠曲草醇提取物的UHPLC-Q-TOF/MS分析

3　討論

通過對(duì)美洲凌霄花甲醇提取物進(jìn)行的UHPLC-Q-TOF/MS分析，已解析得到的化合物中多數(shù)為三萜及其苷類成分，其中化合物13-21與對(duì)照品保留時(shí)間及質(zhì)譜一致，分別鑒定為鐵冬青酸、薔薇酸、委陵菜酸、常春藤皂苷元、山楂酸、柯羅索酸、19α-羥基熊果酸、齊墩果酸、熊果酸；化合物1、8、9、10、11、12均為三萜及其皂苷類成分，化合物8、9、10、11在凌霄屬植物中未見報(bào)道；化合物2、3、4、5、6在凌霄花中曾有報(bào)道，其中3、4、5、6為苯乙醇苷類成分，化合物2為環(huán)烯醚萜苷。由此推測(cè)美洲凌霄花中主要成分為三萜類、黃酮類、苯乙醇苷類及環(huán)烯醚萜類化合物，與凌霄花[3]中所報(bào)道的化合物結(jié)構(gòu)類型基本一致。對(duì)秋鼠曲草醇提取物進(jìn)行的UHPLC-Q-TOF/MS分析，已解析得到的化合物中多數(shù)為黃酮及其苷類成分，其中化合物10、13、15、16與對(duì)照品保留時(shí)間及質(zhì)譜一致，分別鑒定為luteolin-4’-O-β-D-glucoside、木犀草素、芹菜素、5， 7-二羥基-3， 8， 4’-三甲氧基黃酮。