天然植物提取物對雞肉腸中單增李斯特菌及產品特性的影響

王　衛(wèi)，熊　緯，孫然然，吉莉莉，張佳敏，白　婷

(1.成都大學 肉類加工四川省重點實驗室，四川 成都　610106；2.聞達食品配料有限公司，山東 大連　116000)

0　引　言

硝酸鹽在肉制品的生產過程中具有發(fā)色、防腐、抑菌等功效，其廉價、高效和安全性雖通過長期的研究與應用已得到行業(yè)的公認，但若不當使用或濫用則可能導致形成硝胺的潛在風險[1].為此，尋找更為安全可靠、經濟適用，能替代硝鹽在肉制品生產中的多種功能添加劑一直受到的科研人員關注.目前，使用比較多的是芹菜汁粉類產品、天然香辛料和水果提取物及其微生物發(fā)酵產物[2-3].研究發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌廣泛存在于自然界中，是一種常見的食源性致病菌和人畜共患病病原菌，具有極強的生存能力，可在較低溫(低至-0.4℃)、酸性、高鹽的環(huán)境中生長，其對低溫肉制品，尤其是不經二次殺菌而依賴冷鏈和嚴格衛(wèi)生條件來延長貨架期的即食熟肉制品，極易導致較大的安全性隱患[4-5].相關研究表明，硝鹽(硝酸鹽和亞硝酸鹽)雖對單增李斯特菌具有較好的抑制作用，但仍不能完全抑制其生長和將其殺滅，因此，實際生產中通常將有機酸鹽與硝酸鹽結合來控制并抑制單增李斯特菌的生長繁殖[6-8].可以說，有關單增李斯特菌在肉制品中的特性及其有效控制長期以來一直是肉品安全研究的重點[9]，而挑戰(zhàn)實驗也成為驗證各種方法對單增李斯特菌等有害微生物抑制作用的有效手段[10-11].對此，本研究選擇商業(yè)化的T4NW S、DV和CS天然植物提取物來替代硝鹽在肉制品中的抑菌作用，以低溫雞肉腸為對象，單增李斯特菌作為靶向抑制菌株，采用經典化學防腐劑組合(1.56 mg/kg亞硝酸鈉+3.5% SD4+5.5 mg/kg異抗壞血酸鈉)與乳酸鏈球菌素Nisin作為比較，通過微生物挑戰(zhàn)實驗(MCT)對其抑菌效能進行研究，并進一步分析了植物提取物對產品色澤、pH值、水分含量、aw、質構等特性的影響，以期為替代硝鹽功效并更為安全的天然植物提取物的應用，以及無硝產品的開發(fā)提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1　材　料

1.1.1材料與試劑.

1)肉料及試劑.雞肉，購自四川玉冠農業(yè)股份有限公司；TSB(胰酪胨大豆蛋白肉湯)、MOX(改良牛津瓊脂)、BHI(腦心浸出液肉湯)，購自北京路橋技術有限責任公司；瓊脂、亞硝酸鈉，購自成都金山化工有限公司；乙酸鈉—雙乙酸鈉(SD4)，購自武漢豐竹林化學科技有限公司.

2)天然抑菌劑.T4NW S、DV和CS，由蘇州聞達食品有限公司提供，其主要成分為檸檬、甜橙、葡萄柚、石榴提取物，以及發(fā)酵糖粗提物等.

3)供試菌種.單增李斯特菌為4株菌(ATCC 19114、ATCC 19115、ATCC 19116、ATCC 19117)的混合物，由上?；墼派锟萍加邢薰咎峁?

1.1.2儀器與設備.

實驗所用的儀器與設備包括：TU-1800型紫外—可見分光光度計(北京普析儀器公司)；AL-104型精密電子天平(上海梅特勒—托利多儀器設備有限公司)；300ES-12型半自動切片機(順菱切片機有限公司)；XW-80A型渦旋振蕩器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；PHS-3C-01型pH計(上海三信儀表廠)；HC-2518型高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司).

1.2　方　法

1.2.1實驗組設置.

根據(jù)預實驗的篩選及各商業(yè)化天然植物提取物的推薦使用量，并與傳統(tǒng)經典研制與配伍(NaNO2異VC-Na+SD4)、天然微生物發(fā)酵產物(Nisin)進行組合搭配設置的實驗組如表1所示.

表1　實驗組設置

1.2.2雞肉腸制備.

本實驗用雞肉腸產品配方如表2所示.

表2　雞肉腸產品配方

雞肉腸產品制作工藝與常規(guī)工業(yè)化低溫雞肉腸產品相同，即：原料解凍后切塊，入斬拌機絞制并加入輔料細斬為乳化肉糜，灌裝入腸衣后入自動蒸煮煙熏箱蒸煮，蒸煮至腸體中心溫度75 ℃，冷卻后產品切片，真空包裝并在4 ℃條件下低溫冷藏.

1.2.3菌株的活化與保藏.

分別將單增李斯特菌(ATCC 19114、ATCC 19115、ATCC 19116及ATCC 19117)菌株的凍干粉于BHI液體培養(yǎng)基中活化(37 ℃，16～18 h)，后轉至TSA平板上培養(yǎng)出單菌落(37 ℃，24 h)，并同時用MOX平板涂布檢測其純度，挑取TSB平板上生長的單菌落接種于斜面TSB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h，之后取出置于低溫(4 ℃)條件下保藏備用.

1.2.4接種菌懸液的制備.

實驗時，將斜面保藏的單增李斯特菌菌株用一定量的0.85%的生理鹽水沖洗，之后各吸取1 mL該菌株的菌懸液配置成混合菌懸液，用渦旋混合器混勻，并計數(shù).接種時，經梯度稀釋使最終接種菌懸液的濃度調至約5 lg(CFU/g).

1.2.5接種、包裝及貯藏.

將按“1.2.2”項下方式制得的低溫雞肉腸切片后，立即進行定量包裝，25g/包，約4片，然后吸取250 μL菌懸液接種于切片兩面(接觸包裝袋的一面除外)，使最終接種濃度約為2～3 lg(CFU/g)，最后將接種好的樣本抽真空后置于7 ℃冷藏柜中貯藏.每組樣本制備3份，每次每組抽取3個樣本檢測.

1.2.6指標檢測.

1)單增李斯特菌的檢測.將保藏于4 ℃條件下的樣品捏碎，轉移至無菌的均質袋中，加入225 mL無菌水，用均質器拍打5 min，使雞肉腸中的單增李斯特菌充分的洗脫下來.檢測時，使用0.85% NaCl和0.1%蛋白胨混合的蛋白胨水進行梯度稀釋，選擇合適的稀釋度用移液槍吸取100 μL于MOX選擇性培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻，37 ℃下培養(yǎng)48 h，對單增李斯特菌進行計數(shù).

2)水分活度測定.水分活度測定參照GB/T 5009.238-2016《食品安全國家標準 食品水分活度的測定》方法，直接采用水分活度儀測定.

3)亞硝酸鹽殘留量測定.亞硝酸鹽殘留量測定參照GB 5009.33-2010《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》方法，具體步驟為：取5 g勻漿樣品加入12.5 mL飽和硼砂溶液，加入300 mL 、70 ℃水溶解，100 ℃水浴15 min后冷卻至室溫，加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入5 mL乙酸鋅溶液后定容至500 mL，放置30 min后過濾，40 mL濾液于50 mL比色管中加入2 mL對氨基苯磺酸溶液，靜置5 min后加入1 mL鹽酸奈乙二胺溶液，加水至刻度，靜置15 min后，于波長538 nm處測定吸光值.

4)食鹽含量測定.食鹽含量測定參照GB/T 5009.42-2016《食品安全國家標準 食鹽指標的測定》方法，具體步驟為：稱取25 g樣品溶于500 mL水中，取25 mL濾液定溶于250 mL，再取25 mL混合液加入25 mL水后使用鉻酸鉀指示液進行硝酸銀標準溶液滴定.

5)pH值測定.pH值測定方法為，取10 g樣品加入90 mL蒸餾水(pH值為7.0)中，攪拌均勻后靜置，插入電極帶度數(shù)穩(wěn)定后讀取數(shù)值.pH計電極用4.0和7.0的磷酸鹽緩沖液進行校正.

6)質構特性測定.質構實驗參照文獻[12]的方法，具體步驟為：選取低溫雞肉腸的中部進行測定，將其切割成3 cm高的柱體，以P/36R-圓柱形平底探頭進行質構剖面分析(TPA)，測試前速率為2 mm/s，測試速率為1 mm/s，測試后速率為10 mm/s，壓縮距離為15 mm，啟動形式為auto-5 g，數(shù)據(jù)獲取速率為200 pps，每個處理組樣品測定3次，記錄測試結果.以測試開始到結束的力變形曲線上最大峰值力值作為硬度指標，二次壓縮和一次壓縮高度之比為彈性指標.

2　結果與分析

2.1　天然植物提取物等抑菌劑對雞肉腸單增李斯特菌的影響

各實驗組單增李斯特菌檢測結果見表3.

表3　各實驗組單增李斯特菌生長菌落數(shù)lg(CFU/g)

數(shù)據(jù)顯示，在前12 d貯藏期內，空白對照組C1中的單增李斯特菌增長了3.7 lg(CFU/g)，在第26 d達到8.7 lg(CFU/g)，貯藏期單增李斯特菌生長繁殖最快，與他添加有植物提取物或抑菌劑的組別呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01).添加“亞硝酸鈉+SD4+異抗壞血酸鈉"的C2組在53 d檢測期內單增李斯特菌的增量至第6周增長無顯著變化(P>0.05)，至第7周也上升甚微，為各組中抑菌效能最佳組別.

實驗結果表明，添加了1%DV的T1組，在53 d的檢測期內單增李斯特菌的增長量小于0.5 lg(CFU/g)，顯示出其對單增李斯特菌具有顯著(P<0.05)的抑菌效果；添加了0.5% CS+0.5% DV的T3組和添加0.6% T4NW S+0.5% CS的T2組，兩者在53 d檢測期內的單增李斯特菌增量分別為2.1 lg和1.3 lg(CFU/g)；而僅添加2 mg/kg Nisin的T4組中，單增李斯特菌在前19 d貯藏期的增長量為0.9 lg(CFU/g)，在第26 d檢測時達到2.9 lg(CFU/g)，與其余各實驗組比較生長繁殖較快，呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，僅低于對照C1組；而在添加有1 mg/kg Nisin+0.5% DV的T5組中，整個檢測期內(53 d)其單增李斯特菌增長量為2.1 lg(CFU/g)，相較于T4組雖然減少了Nisin的添加量，但由于加入了DV，不同組合間的協(xié)同效應也開始顯現(xiàn)，其效果也遠遠優(yōu)于單純添加1 %DV 的T1組和只添加1 mg/kg Nisin的T4組.總體來看，對單增李斯特菌抑制效果最好的仍然是傳統(tǒng)的“亞硝酸鈉+SD4+異抗壞血酸鈉"經典組合C2組，產品貯藏至第7周仍然只有3.7 lg(CFU/g)，抑菌效果能夠完全替代其作用的是0.6% T4NW S+0.5% CS組合的T2組，其次是1.0% DV的T1組和0.5% CS+0.5% DV的T3組.只添加2 mg/kg Nisin的T4組對單增李斯特菌的抑制在添加有植物提取物的各組中效果最差，但仍然呈現(xiàn)對單增李斯特菌較好地抑制效應.有研究表明，Nisin單獨使用時,對單增李斯特菌的最小抑菌濃度為200 μg /mL[13]，但并不是濃度越高抑菌效果越好，在達到一定濃度后，其效果逐步穩(wěn)定在一定范圍[14].

2.2　天然植物提取物等抑菌劑對雞肉腸aw、NaCl、NaNO2等的影響

本實驗中的雞肉腸產品理化指標如表4所示.

表4　雞肉腸理化指標測定結果

數(shù)據(jù)顯示，實驗各組pH 6.39～6.48，aw0.97～0.99，NaCl 1.75～1.89，未呈現(xiàn)顯著差異(P>0.05).亞硝殘留添加有“亞硝酸鈉+SD4+異抗壞血酸鈉"經典組合的C2組為58.61 mg/kg，其余各組為0.表明除C2組的亞硝殘留外，添加物未對雞肉腸產品理化指標產生影響.

2.3　天然植物提取物等抑菌劑對雞肉腸pH值的影響

實驗中，各組別雞肉腸產品貯藏期pH值測定結果見表5.

表5　4 ℃條件下低溫雞肉腸樣品pH值

表5數(shù)據(jù)顯示，在樣品貯藏的初期，各處理組樣品的pH值均在6.22～6.45之間，隨著貯藏時間的延長，各處理組樣品中的pH值均呈現(xiàn)下降的趨勢,其中不添加防腐抑菌劑的空白對照組下降最大，而添加了天然抑菌劑T4N和T10的組和空白處理組的下降趨勢相近，添加T4N的組下降趨勢甚至比空白處理組的下降趨勢更加迅速.pH值下降相對較慢的是添加了傳統(tǒng)化學防腐劑實驗組和植物提取物的T10組和DV組，這2種抑菌劑均顯示出可有效減緩低溫雞肉腸產品pH值的下降，DV組在產品貯藏的前期能有效減緩樣品pH值的下降，但在第35 d之后，其作用有所減弱.

2.4　天然植物提取物等抑菌劑對雞肉腸質構特性的影響

實驗中，各組別雞肉腸產品質構測定結果見表6.

表6　添加抑菌劑對低溫雞肉腸質構的影響

表6數(shù)據(jù)顯示，在低溫雞肉腸產品貯藏初始，不同的防腐抑菌劑添加已對產品的質構特性產生了影響.與不添加抑菌劑的空白對照相比，天然抑菌劑T10、DV、以及T10+DV均在一定程度上提高了產品的硬度，但差異不是很顯著(P<0.05)，而各組的彈性差異則不顯著(P>0.05).

3　結　論

本研究選擇T4NW S、DV和CS天然植物提取物來替代硝鹽在肉制品中的抑菌作用，以低溫雞肉腸產品為對象，單增李斯特菌為靶向抑制菌株，通過微生物挑戰(zhàn)實驗(MCT)對其抑菌效能進行了分析，并與經典化學防腐劑組合(1.56 mg/kg亞硝酸鈉+3.5% SD4+5.5 mg/kg異抗壞血酸鈉)及乳酸鏈球菌素Nisin進行了比較.實驗結果顯示，對單增李斯特菌抑制效果最好的是傳統(tǒng)的“亞硝酸鈉+SD4+異抗壞血酸鈉"經典組合，但植物提取物在不同程度上可替代硝鹽顯著的抑菌作用，能夠完全替代其作用的是0.6% T4NW S+0.5% CS，其次是1.0% DV，以及0.5% CS+0.5% DV.盡管只添加2 mg/kg Nisin對單增李斯特菌的抑菌效果最差，但仍然呈現(xiàn)出較顯著的抑制效應.不同提取物產品還顯現(xiàn)出互作效應(柵欄效應)，例如1 mg/kg Nisin+0.5% DV的組合，抑菌效果就遠遠優(yōu)于單獨添加1.0% DV或2 mg/kg Nisin的產品.

進一步的產品特性分析顯示，植物提取物可完全替代傳統(tǒng)硝鹽的發(fā)色作用，其中T10組呈現(xiàn)較佳色澤，其a*值甚至略高于添加硝鹽組.同時，隨著貯藏時間的延長，各組產品pH值均有所下降，但添加了植物提取物的產品下降度更低，尤其是DV和T10+DV組顯著更佳.各組別aw、NaCl等無顯著差異.NaNO2的殘留，除添加了亞硝酸鈉的產品接近60 mg/kg外，其余各組均未檢出.硬度和彈性等的質構檢測各組未呈現(xiàn)特別顯著的差異.

雞肉腸是典型的低溫肉制品，貯運過程中單增李斯特菌的控制是低溫肉制品面臨的難題.為保證產品微生物穩(wěn)定性和產品安全性，硝鹽類添加劑的應用就顯得特別重要，這對于綠色、有機產品的開發(fā)，以及推行清潔標簽化，往往成為難以逾越的障礙，而替代硝鹽的天然植物提取物的應用，為解決此難題提供了可能.