麥冬皂苷體外溶血作用研究

劉　濤，徐騰達(dá)，梁　悅，張　倩，鄧燕君，彭曉鳳，徐玉玲

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都　610106)

0　引　言

麥冬為百合科沿階草屬植物麥冬的肉質(zhì)塊莖，具有養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除煩等功效.臨床常用于治療冠心病、心絞痛等癥[1-2].目前，麥冬藥材常用于中藥注射劑中，如麥冬注射液、參麥注射液、紅參麥冬復(fù)方注射液等[3-5].相關(guān)研究與報道顯示，麥冬的主要成分之一為甾體皂苷，而皂苷類成分一般具有溶血作用，因此，該類中藥注射液的主要不良反應(yīng)為產(chǎn)生溶血現(xiàn)象[6-8].對此，本研究通過制備不同純度的麥冬皂苷樣品，在一定質(zhì)量濃度梯度下進(jìn)行體外溶血實(shí)驗(yàn)，探討麥冬皂苷的溶血作用，擬為保證相關(guān)藥物的臨床應(yīng)用安全提供依據(jù).

1　材料與儀器

1.1　材　料

1.1.1材料.

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：麥冬(產(chǎn)地四川，批號，20170621)，購自成都荷花池藥材批發(fā)市場，經(jīng)檢驗(yàn)為百合科沿階草屬植物麥冬的肉質(zhì)塊莖；新西蘭大白兔，雄性，體質(zhì)量2 Kg，普通級，購自成都達(dá)碩試驗(yàn)動物有限公司(合格證號，SCXK(川)2013-17).實(shí)驗(yàn)中對動物的處理遵循相關(guān)動物使用的倫理學(xué)原則.

1.1.2試劑.

實(shí)驗(yàn)所用試劑包括：魯斯可皂苷元對照品(批號，151220，純度≥98%)，購自四川維克奇生物科技有限公司；生理鹽水(0.9%氯化鈉注射液，批號，B15042001)，購自四川科倫藥業(yè)公司；正丁醇(批號，20160121)、高氯酸(批號，20151021)、95%乙醇(批號，20151002)，均購自成都科龍化工試劑廠；試劑均為分析純，水為怡寶純凈水.

1.2　儀　器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：TU-1810型紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，F(xiàn)A-2004型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)，TD-5型離心機(jī)(長沙英泰儀器有限公司)，DH-3600A型電熱恒溫培養(yǎng)箱(西安禾普生物科技有限公司)，RE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(成都康宇科技有限公司)，DZF-6050型真空干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司).

2　方法與結(jié)果

2.1　不同純度麥冬供試品溶液的制備

2.1.1麥冬皂苷A溶液的制備.

取500 g麥冬，加4 000 mL 60 %乙醇，提取3次，每次1.5 h.過濾提取液，80 ℃減壓濃縮，醇沉(醇沉濃度為80%)，靜置24 h，過濾，于80 ℃下，減壓濃縮與減壓干燥，得麥冬皂苷浸膏A.取適量浸膏A加生理鹽水，超聲1 min，配制成麥冬皂苷A儲備溶液，其皂苷純度為4.0%.取適量該儲備液，加生理鹽水分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mg/mL的溶液作為麥冬皂苷A溶液的供試品溶液.

2.1.2麥冬皂苷B溶液的制備.

取“2.1.1”項(xiàng)下麥冬皂苷浸膏A適量，加純凈水溶解，過AB-8型大孔樹脂純化.然后，用純凈水和70%乙醇分別洗脫，分別接收洗脫液，并于80 ℃下，分別減壓濃縮與減壓干燥，得麥冬皂苷浸膏B和分離物浸膏.取適量浸膏B加生理鹽水，超聲1 min，配制成麥冬皂苷B儲備液，其皂苷純度為17.2%.取適量該儲備液加生理鹽水分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.03，0.06，0.12，0.18，0.24，0.30 mg/mL的溶液作為麥冬皂苷B溶液的供試品溶液.同時，分離物浸膏按照與浸膏B純化時的比例進(jìn)行稀釋配制，作為分離物供試品溶液.

2.1.3麥冬皂苷C溶液的配制.

取“2.1.2”項(xiàng)下麥冬皂苷浸膏B適量，加純凈水超聲1 min溶解，加等量水飽和正丁醇萃取4次，收集萃取液和萃余液，于80 ℃下，減壓濃縮與減壓干燥，得麥冬皂苷浸膏C和萃余液浸膏.取適量浸膏C加生理鹽水，超聲1 min，配制成麥冬皂苷C儲備液，其皂苷純度為73.8%.取適量該儲備液加生理鹽水分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.03，0.06，0.12，0.18，0.24，0.30 mg/mL的溶液作為麥冬皂苷C溶液的供試品溶液.同時，萃余液浸膏按照與浸膏C萃取時的比例進(jìn)行稀釋配制，作為萃余液供試品溶液.

2.2　2%紅細(xì)胞混懸液的配制[9]

從家兔耳緣靜脈取新鮮血液10 mL，置燒杯中，用纏有少量脫脂棉的玻璃棒輕輕攪拌約10 min，取出血液中的纖維蛋白，制成脫纖血液，加入約10倍量生理鹽水，搖勻，3 000 r/min離心10 min，棄去上清液.按此方法重復(fù)4～5次，洗至上清液呈無色透明.將所得紅細(xì)胞用生理鹽水配制成壓積為2%的紅細(xì)胞混懸液，置4 ℃冰箱中保存，備用.

2.3　溶血率測定條件選擇

2.3.1吸收波長選擇.

《中國藥典》2015版第四部中規(guī)定的溶血率測定方法中僅能定性鑒別藥物的溶血性，而不能定量測定藥物溶血率的大小.對此，本研究通過篩選，選定利用紫外分光光度法測定體外紅細(xì)胞的溶血率[10]，其最大吸收波長為關(guān)鍵參數(shù)，確定步驟為：以生理鹽水2 mL中加入兔紅細(xì)胞混懸液2 mL為陰性對照組，以純凈水2 mL中加入兔紅細(xì)胞混懸液2 mL為陽性對照組；取“2.1”項(xiàng)下麥冬皂苷A供試品溶液4 mL為樣品組.取各組溶液，搖勻，置于(37±0.5)℃保溫培養(yǎng)箱中保溫3 h，取出于3 000 r/min離心10 min，取上清液至比色皿中.以陰性組為空白，對陽性對照組和樣品組于波長200～700 nm進(jìn)行光譜掃描.結(jié)果顯示，其最大吸收波長為540 nm，且樣品組在該波長下無干擾吸收.故選擇540 nm波長為溶血率的測定波長.

2.3.2保溫時間選擇.

按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備陰性和陽性對照組，將“2.1”項(xiàng)下麥冬皂苷A供試品溶液2 mL中加入兔紅細(xì)胞混懸液2 mL為樣品組.取各組溶液輕輕振搖，混合均勻，置于(37±0.5)℃保溫培養(yǎng)箱中保溫0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，取出于3 000 r/min離心10 min，取上清液至比色皿中，在540 nm波長下測定吸光度.結(jié)果表明，在2.5～4.0 h范圍內(nèi)，紅細(xì)胞溶血趨于穩(wěn)定.故選擇保溫時間為3 h.

2.3.3重復(fù)性考察.

按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備陰性和陽性對照組，將“2.1”項(xiàng)下麥冬皂苷A供試品溶液2 mL中加入兔紅細(xì)胞混懸液2 mL為樣品組.配制6組，將各組溶液輕輕振搖，混合均勻，置于(37±0.5)℃保溫培養(yǎng)箱中保溫3.0 h，取出于3 000 r/min離心10 min，取上清液至比色皿中，在540 nm波長下測定吸光度，結(jié)果見表1.

表1　吸光度重復(fù)性測試

2.3.4溶血率測定.

溶血率的測定采用紫外分光光度法，其步驟為：以生理鹽水2 mL中加入兔紅細(xì)胞混懸液2 mL為陰性對照組，以純凈水2 mL中加入兔紅細(xì)胞混懸液2 mL為陽性對照組，按“2.1”項(xiàng)下方法制備的供試品按相應(yīng)要求進(jìn)行加樣配制為樣品組.取各組溶液輕輕振搖，混合均勻，置于(37±0.5)℃保溫培養(yǎng)箱中保溫3 h，取出于3 000 r/min離心10 min，取上清液至比色皿中.以陰性組為空白，采用比色法于波長540 nm下分別測定陽性組的吸光度(A陽)和樣品組的吸光度(A樣)，并按，溶血率=A樣/A陽×100%，計(jì)算溶血率，同時繪制各樣品的溶血率—質(zhì)量濃度曲線.

2.4　溶血濃度考察

按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性和陽性對照組，將“2.1”項(xiàng)下各麥冬皂苷供試品溶液2 mL中加入兔紅細(xì)胞混懸液2 mL為樣品組.取各組溶液輕輕振搖，混合均勻，置于(37±0.5)℃保溫培養(yǎng)箱中保溫3.0 h，取出于3 000 r/min離心10 min，取上清液至比色皿中.在540 nm波長下測定吸光度.計(jì)算溶血率.結(jié)果見圖1、表2.

圖1麥冬皂苷溶血率—質(zhì)量濃度曲線

表2　麥冬皂苷溶血濃度

溶血作用的判斷方法參考文獻(xiàn)[11]中的相關(guān)判斷依據(jù)，即：體外紅細(xì)胞的溶血率>5%表示有溶血作用；溶血率≤5%表示沒有溶血作用.由圖1及表1可知：當(dāng)皂苷純度為4%時，質(zhì)量濃度為0.06 mg/mL時，未出現(xiàn)溶血，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL時，溶血率上升至13%；當(dāng)皂苷純度為17%時，質(zhì)量濃度為0.06 mg/mL時，未出現(xiàn)溶血，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL時，溶血率上升至15%；當(dāng)麥冬皂苷純度為73%時，質(zhì)量濃度為0.03 mg/mL時，未發(fā)生溶血，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.06 mg/mL時，溶血率上升至12.5%.據(jù)此可知，麥冬皂苷具有體外溶血作用，且麥冬皂苷純度越高，其溶血率越大.

2.5　不同純化方法對皂苷溶血作用的影響

取大孔樹脂及萃取純化后所得到的麥冬皂苷及其相應(yīng)的“雜質(zhì)”溶液，按照按表3配制溶液.

表3　溶血還原溶液

將各組溶液輕輕振搖，混合均勻，置于(37±0.5)℃保溫培養(yǎng)箱中保溫3.0 h，取出于3 000 r/min離心10 min，取上清液至比色皿中.在540 nm波長下測定吸光度，計(jì)算溶血率，結(jié)果見表4.

表4　不同純化方法對皂苷溶血作用的影響

由表4中1#，2#，3#數(shù)據(jù)得出：大孔樹脂純化后的“雜質(zhì)”與皂苷B溶液按照純化前的比例進(jìn)行混合還原后所得溶液的溶血率比皂苷A和皂苷B溶液的溶血率高，由2#，4#，5#數(shù)據(jù)得出正丁醇萃取后的萃余液和萃取液混合還原后的溶血率比皂苷B高，但和皂苷C溶液的溶血率大致相同.

3　結(jié)果與討論

3.1　結(jié)　果

本研究通過配制不同純度與不同濃度的麥冬皂苷溶液進(jìn)行體外溶血研究，采用紫外分光光度法測定溶血率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，麥冬皂苷具有體外溶血作用，其溶血率隨皂苷濃度升高而增大，且麥冬皂苷純度越高，其溶血率越大.對不同純化方式所得到的“雜質(zhì)”與皂苷類成分按比例混合“還原”后的溶血實(shí)驗(yàn)表明，采用正丁醇萃取的純化方式還原后，萃取前后的溶血作用基本不變，而采用大孔樹脂純化后的兩部分物質(zhì)混合“還原”后溶血作用高于純化前的溶血作用.

3.2　討　論

中藥具有成分復(fù)雜與作用機(jī)理尚不明確的特點(diǎn)，隨著中藥注射液臨床應(yīng)用越來越多，其安全性研究有待加強(qiáng).目前，在中藥注射液的制法中，科研人員經(jīng)常將主要藥用成分進(jìn)行分離純化，以減小藥物副作用和達(dá)到更好的藥用療效.本研究表明，麥冬皂苷純度越高，其相同濃度皂苷的溶血率越大.因此，在配制含有皂苷類成分的注射液時皂苷類成分是否越純越好，純度越高是否療效越好，這是在中成藥工藝研究過程中設(shè)計(jì)含皂苷類成分的藥材純化工藝時應(yīng)重點(diǎn)考慮的問題.此外，據(jù)文獻(xiàn)報道,大孔樹脂的吸附純化為物理吸附，對藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)不會造成影響[12-13].而本實(shí)驗(yàn)中通過大孔樹脂純化麥冬皂苷，得到的“雜質(zhì)”與皂苷類成分按比例混合“還原”后，其溶血作用發(fā)生了較大的改變，而通過正丁醇萃取純化麥冬皂苷，得到的“雜質(zhì)”與皂苷類成分按比例混合“還原”后，其溶血作用未發(fā)生明顯的變化，其原因有待進(jìn)一步研究.