彌漫性軸索損傷生物標志物的研究進展*

朱士勝，張　鵬　綜述，趙　鵬，李劍波△審校（.重慶醫(yī)藥高等?？茖W校醫(yī)學技術學院，重慶4033；2.重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)學教研室，重慶40006；3.重慶市刑事偵查工程技術研究中心40006；4.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校臨床系，貴州遵義563006）

彌漫性軸索損傷（DAI）是一種常見的腦損傷，是造成重型腦損傷患者不良預后的主要原因之一，其病理特點是軸索廣泛的損害[1]。DAI嚴重危害患者的生命健康，其病理生理機制仍不清楚，臨床迄今為止尚無治療DAI的有效藥物和措施。近年來，隨著研究的不斷深入，在DAI的早期診斷、治療及預后等方面已取得了很大的進展，發(fā)現(xiàn)了較多與DAI發(fā)病機制、早期診斷與預后評估相關的特異性強、靈敏性好的生物標志物，為進一步探索DAI的病理生理機制、了解DAI患者的癥狀、體征及病程進展，提高DAI的診治水平提供了重要參考?，F(xiàn)就彌漫性軸索損傷生物標志物的研究進展進行綜述。

1　研究背景

DAI尚無統(tǒng)一的診斷標準。臨床上DAI的診斷主要依賴于典型的臨床表現(xiàn)和影像學檢查[2]；然而，DAI的臨床癥狀十分復雜，部分DAI患者（尤其是輕型DAI患者）無特殊的臨床表現(xiàn)，同時，CT檢查受其分辨率限制，存在靈敏性差、假陰性較高的缺陷。常規(guī)MRI檢查在DAI診斷方面優(yōu)于CT，然而，相當一部分DAI患者仍不能被CT或MRI等影像檢查發(fā)現(xiàn)[3]。其他先進的影像學技術，如 DWI、DTI、梯度回波序列（GRE）-磁敏感加權成像（SWI）等在DAI的診斷中也有應用，但這些影像學技術耗時長、檢查時對患者要求高、成本昂貴，嚴重限制了其應用的范圍[3]。由于目前臨床檢查無法滿足對DAI的診斷、療效評價、預后評估等方面的需求。為了早期、準確地診斷DAI，彌補影像學及臨床特征診斷DAI的不足，眾多學者積極地研究與DAI發(fā)病機制、早期診斷與預后評估相關的生物標志物。

2　DAI的生物標志物

2.1神經(jīng)絲蛋白（NFs） NFs主要定位于軸突，是組成細胞骨架的一部分[4]。NFs是由3條多肽鏈構成，分別為輕鏈（NF-L，68×103）、中鏈（NF-M，160×103）和重鏈（NFH，200×103）[5]。每個 NFs亞單位具有一個長且含有大量高度磷酸化的羧基末端。非磷酸化的NFs亞基位于神經(jīng)元胞體內(nèi)，可隨著軸突運輸流動，并可在軸突斷端積累[6]。NFs磷酸化的程度與軸突直徑和軸突運輸?shù)乃俣瘸收嚓P[7-8]。NFs亞基的磷酸化和去磷酸化之間的平衡在調(diào)節(jié)軸突組織結(jié)構和功能中發(fā)揮重要作用。

當發(fā)生DAI時，神經(jīng)細胞膜通透性增高，鈣離子內(nèi)流入神經(jīng)軸索并激活鈣調(diào)磷酸酶，擾亂了NFs亞基的磷酸化狀態(tài)，導致細胞骨架完整性局部喪失。隨后，活化的鈣蛋白酶和半胱天冬酶-3可介導NFs的去磷酸化和蛋白的水解，導致NFs在軸突中心塌陷成緊密包裹的束，這些改變導致了NFs的降解。JAFARI等[9]研究發(fā)現(xiàn)，豬發(fā)生DAI后NFs在軸突間隙含量降低52.9%。

軸索損傷后，NF-L會在幾個小時內(nèi)降解為多肽片段[6]。大鼠和豬的動物實驗表明，磷酸化的NF-L水平于傷后30 min至6 h在胼胝體內(nèi)降低50%[6]。NF-L的免疫反應于傷后1 d增高，傷后3 d增加更加顯著。NF-L免疫反應研究發(fā)現(xiàn)，傷后6 h軸索出現(xiàn)腫脹、扭曲；傷后24hNF-L免疫反應結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量軸索腫脹，直徑為10μm，并可在軸索斷端發(fā)現(xiàn)典型的收縮球。同時，研究發(fā)現(xiàn)，NF-L免疫反應并未出現(xiàn)在神經(jīng)元胞體和樹突。因此，在NFs的3個亞基中，NF-L對神經(jīng)軸索的損傷最敏感和特異。NF-L片段也可以在腦脊液（CSF）中檢測到，其最低檢測含量為5 ng/L，是中型創(chuàng)傷性腦損傷CSF含量的平均值。

目前仍未發(fā)現(xiàn)NF-M可作為軸索損傷的標志物。動物實驗發(fā)現(xiàn)，軸索損傷24 h后NF-M可呈陽性反應[6]。磷酸化的NF-H可于傷后6 h在血清中檢測到，并于傷后12 h初次達到峰值，隨后降低，并于傷后2 d達到更高的峰值，最后于傷后7 d降低至正常水平。傷后血清中磷酸化NF-H水平的變化規(guī)律，可能與DAI中原發(fā)性軸索斷裂和繼發(fā)性軸索斷裂相對應；提示繼發(fā)性軸索斷裂可能較原發(fā)性軸索斷裂對軸索的損害更重。磷酸化的NF-H有望成為評估患者軸索損傷新的特異性潛在標志物[5]。

2.2微管相關蛋白tau（MAP-tau） MAP-tau是與微管蛋白結(jié)合的一類蛋白，相對分子質(zhì)量為48×103～67×103[10]。MAP-tau具有穩(wěn)定微管結(jié)構、參與軸漿轉(zhuǎn)運的作用。在生理狀態(tài)下，MAP-tau不易被檢測到。軸索損傷時，激活的中性蛋白酶會解聚胞體和軸索的微管，導致MAP-tau的過度磷酸化，引起神經(jīng)纖維的纏結(jié)。同時，MAP-tau可被鈣蛋白酶1、3裂解為C-tau，而C-tau可擴散到CSF和血清，這使得其有望成為一種潛在的特異性的DAI生物標志物[11]。

有研究發(fā)現(xiàn)，血清及CSF中C-tau的水平與患者臨床病情改善、預后呈負相關，提示其可用于患者軸索損傷程度評估、藥物療效監(jiān)測等[11]。同時，CSF中C-tau的水平可在CT檢查未見異常的患者中升高，提示其可作為軸索損傷有價值的生物標志物[11]。

2.3髓鞘堿性蛋白（MBP） MBP是腦白質(zhì)中含量最多的蛋白質(zhì)之一，約占髓鞘蛋白的30%；由4個主要的亞基組成，相對分子質(zhì)量分別為 21.5×103、18.5×103、17×103、14×103[12]。軸索損傷后，激活的鈣蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶和溶酶體蛋白酶會導致MBP亞基的降解。

動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，挫傷的腦皮質(zhì)內(nèi)MBP的含量于傷后2 h降低，并于傷后2 d降低至最低水平，隨后于傷后3～7 d升高至正常水平。相應地，MBP氮端相對分子質(zhì)量為8×103～10×103的降解產(chǎn)物，最初于傷后2 h在腦皮質(zhì)中積累，于傷后1～2 d升高至峰值，并于傷后6～7 d恢復至正常水平。MBP降解產(chǎn)物可在CSF中檢測到，然而其靈敏性較在腦皮質(zhì)差。血漿中MBP降解產(chǎn)物于傷后2～3 d升高，并可持續(xù)至傷后2周。有研究結(jié)果表明，MBP作為DAI標志物的靈敏性為87%，特異性為100%[13]。雖然，MBP在過去很長一段時間被認為是創(chuàng)傷性腦損傷的潛在生物標志物，但是由于其靈敏性較差，嚴重限制了其臨床應用。

2.4β淀粉樣前體蛋白（β-APP） β-APP是神經(jīng)細胞胞質(zhì)中合成的一種跨膜糖蛋白；其可通過快速軸漿轉(zhuǎn)運至突觸。β-APP在細胞黏附、神經(jīng)元的生長和損傷后修復中發(fā)揮著重要作用[14]。在生理狀態(tài)下，β-APP含量較低，不能通過免疫組化方法檢測到。DAI時β-APP可在軸索收縮球（ARB）內(nèi)快速、大量積累。β-APP可以標記腦白質(zhì)中損傷的軸索和ARB。目前，β-APP在法醫(yī)學中被認為是診斷DAI的有效生物標志物，檢出率為85%[15]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，β-APP存在標記損傷軸索率低的缺陷，為 30%～50%[16]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，蘇木素-伊紅（HE）染色可在顱腦傷后24 h檢出ARB，嗜銀染色可在傷后15～18 h檢出ARB[17]。β-APP免疫組化法的靈敏性較HE染色和嗜銀染色高，可在傷后30 min至1 h內(nèi)檢出軸索損傷，在傷后3 h內(nèi)檢出ARB[18]。

動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，傷后β-APP mRNA可在30 min內(nèi)表達上調(diào)，提示其可作為DAI早期診斷的潛在生物標志物，其靈敏性優(yōu)于MBP及NFs[19]。然而，值得注意的是，β-APP也可在顱腦損傷后非神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構，如施旺細胞和血小板中陽性表達；同時，研究還發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血性腦損傷、一氧化碳中毒、低血糖癥、腔隙性腦梗死患者β-APP也可存在陽性表達。因此，應用β-APP診斷DAI時需特別謹慎以免誤診。目前研究認為，β-APP不應作為DAI診斷的特殊標志物，而應作為廣泛性腦損傷的標志物[20]。

2.5淀粉樣蛋白（Aβ） Aβ是由40～42個氨基酸組成的水溶性多肽。生理狀態(tài)下Aβ合成后主要分泌到神經(jīng)細胞外，其濃度低于檢測水平。DAI后，Aβ可由于β-APP的酶解而在神經(jīng)元胞體內(nèi)大量聚集[21]。大量聚集的Aβ具有神經(jīng)毒性。同時，由于Aβ抗體與β-APP抗體具有相同的分子結(jié)構，故Aβ免疫組化反應時β-APP也可呈陽性表達[22]。

動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，Aβ于傷后1 d在大腦皮層及海馬神經(jīng)元胞體內(nèi)積累，傷后3 d增加更加明顯，傷后6～14 d持續(xù)增加；同時，可在大腦皮層下白質(zhì)的軸索發(fā)現(xiàn)Aβ與NF-L中度至重度免疫組織陽性反應。在對照組實驗動物神經(jīng)元的胞體和軸突中可發(fā)現(xiàn)Aβ微弱的免疫組織陽性反應。前期研究發(fā)現(xiàn)，Aβ在患者的CSF中也顯著增加，并于傷后5～6d升高至正常值的11.73倍，達到峰值；隨后的2周，Aβ水平逐漸降低至正常水平[23]。血漿中Aβ的水平為CSF中的1/100，且傷后不會出現(xiàn)顯著改變，這提示血漿中Aβ水平不能反映CSF中Aβ的代謝情況[21]。

2.6FE65FE65是一個保守的蛋白質(zhì)，其95%的氨基酸序列在人類、小鼠和大鼠相同，因此，F(xiàn)E65動物實驗的結(jié)果可能較好地推廣至人類。FE65是一種銜接蛋白，其參與了β-APP與其細胞內(nèi)固定區(qū)域的銜接。DAI后，F(xiàn)E65表達的上調(diào)會導致β-APP在神經(jīng)元胞體內(nèi)的聚集[23]。大鼠實驗研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)E65 mRNA水平可于傷后30 min升高，并于傷后1 h達到峰值，于傷后12 h降低至正常水平；隨后，F(xiàn)E65 mRNA水平于傷后24 h再次升高，傷后48 h再次降低[24]。FE65 mRNA變化規(guī)律可能與DAI原發(fā)性軸索斷裂和繼發(fā)性軸索斷裂相關。盡管目前仍缺乏人發(fā)生DAI后FE65 mRNA、FE65的變化規(guī)律，但上述動物實驗已表明，F(xiàn)E65 mRNA和FE65有望成為DAI早期診斷的特異性的生物標志物。

2.7神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE） NSE是糖酵解酶烯醇酶的同工酶，相對分子質(zhì)量為78×103。NSE主要位于神經(jīng)元細胞質(zhì)中，其主要參與神經(jīng)元慢速軸漿轉(zhuǎn)運[25]。生理狀態(tài)下，NSE不會被分泌到細胞外。軸索損傷后，上調(diào)的NSE會被釋放到細胞外[26]，因此，體液中NSE對軸突損傷具有較高的特異性和敏感性。

動物實驗發(fā)現(xiàn)，NSE可于軸索損傷后1.5 h呈免疫組化陽性反應；這提示其可作為DAI早期潛在生物標志物。然而，近期研究發(fā)現(xiàn)，紅細胞及血小板中也存在NSE，這可能會嚴重限制NSE在DAI診斷中的應用[27]。盡管如此，研究發(fā)現(xiàn)，NSE可作為重癥顱腦損傷患者預后判斷、治療效果監(jiān)測的生物標志物[28]。前期研究發(fā)現(xiàn)，DAI后6個月內(nèi)，NSE水平與格拉斯格預后評分（GOS評分）呈正相關；NSE作為評估患者預后的標準具有良好的靈敏性和特異性，基于此靈敏性和特異性，NSE有望作為DAI患者預后判斷的生物標志物，對患者預后評估有重要意義[29]。

2.8其他其他與DAI診斷、預后評估等相關的生物標志物還包括環(huán)氧合酶2、水通道蛋-4、白細胞介素1（IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）、堿性成纖維細胞生長因子等[2]。部分DAI生物標志物匯總見表1。

表1　與DAI病理生理機制、早期診斷、預后評估相關的生物標志物

3　展　望

DAI生物標志物的探索是一個相對較新的領域，隨著研究的不斷深入，雖然發(fā)現(xiàn)了較多與DAI發(fā)病機制、早期診斷與預后評估相關的生物標志物，但是由于前期研究工作大多數(shù)側(cè)重于發(fā)現(xiàn)單一的生物標志物，故目前仍未篩選出靈敏性好、特異性強的可應用于臨床DAI患者早期診斷與預后評估的生物標志物[29]。

發(fā)生DAI后軸索的損傷是多因素參與的、一系列原發(fā)性或繼發(fā)性病理生理反應的結(jié)果，因此，單一的生物標志物無法準確地對DAI患者進行早期診斷、預后評估等，聯(lián)合使用多個生物標志物可能會得到更佳的結(jié)果[29]。隨著組學技術和生物信息學技術的興起和不斷發(fā)展，已有學者運用蛋白質(zhì)組學技術、代謝組學技術等研究DAI患者或?qū)嶒瀯游锏哪X組織、血漿、CSF等，篩選出潛在的生物標志物，以期為DAI的發(fā)病機制、早期診斷提供了新的研究思路，并已取得了較理想的研究結(jié)果[30]。同時，盡管前期研究發(fā)現(xiàn)，DAI體液生物標志物存在特異性較差的缺陷，但是，體液具有易獲得、臨床應用簡便等優(yōu)點，故DAI體液生物標志物的探索仍是今后研究的重點[29]。

總之，作為一個具有較高的致殘率、植物生存率、死亡率的特殊腦損傷類型，DAI的早期診斷、藥物治療靶點的確定、預后評估及鑒定等一直困擾臨床工作者和法醫(yī)學者。生物標志物的探索為解開這個難題提供了新的思路，并經(jīng)過近些年的研究，取得了一定成果。隨著組織學技術和生物信息學技術的不斷發(fā)展和完善，必將尋找到與DAI的發(fā)病機制、早期診斷與預后評估相關的特異性強、靈敏性好的生物標志物。