低頻電針足三里對(duì)酒疸證模型大鼠治療作用的尿液代謝組學(xué)研究*

佟　欣，劉學(xué)凱，周　越，付　琳，王　洋，趙法政

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

酒疸是因酒傷所致的黃疸病，是中醫(yī)證候的一種，始見于《金匱要略》記載,以身目俱黃、心中懊憹熱痛、腹?jié)M不欲食、時(shí)時(shí)欲吐、面發(fā)赤斑、足脛滿及小便黃等為主要癥狀[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為酒疸與西醫(yī)學(xué)的酒精依賴相關(guān)，是一種以強(qiáng)迫性飲酒的行為和心理為特點(diǎn)，并伴有體內(nèi)代謝障礙的身心疾病。世界衛(wèi)生組織報(bào)道，由于酒精濫用而引起的一系列社會(huì)問題已成為全球第三大公共衛(wèi)生問題，并呈逐年上升的趨勢(shì)。

關(guān)于酒疸的治療臨床多采取藥物治療的方法，長(zhǎng)期使用導(dǎo)致肝、腎等多臟器的損傷，患者在承受巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的同時(shí)，給身體帶來嚴(yán)重的傷害。針灸療法是在中醫(yī)基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)下，將人的生理和心理作為有機(jī)的整體，具有身心同治的治療優(yōu)勢(shì)[2-3]。在臨床治療的過程中，針灸療法不但充分考慮生物因素對(duì)疾病的影響，更加注重各種心理因素對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸的作用。針灸治療通過辨明病人的身心特點(diǎn)，對(duì)病人進(jìn)行個(gè)性化的治療，方法更人性化，更有利于疾病的治療和康復(fù)，是臨床治療身心疾病安全、有效的方法。

1　材料

1.1　藥品與試劑

α-萘異硫氰酸酯(Sigma公司)；無水乙醇，分析純(天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心)。甲醇，色譜級(jí)(默克公司)；屈臣氏蒸餾水(屈臣氏公司)；甲酸，色譜級(jí)(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；亮氨酸腦啡肽(SIGMA公司)；異丙醇，分析級(jí)(天津博迪化工有限公司)；氫氧化鈉(分析級(jí),天津市化學(xué)制劑六廠)；TBIL試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，20170305)；TAB試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，20170404)；TG試劑盒(上海中醫(yī)藥大學(xué)，20170425) ；CHO試劑盒(上海中醫(yī)藥大學(xué)，20170202)。

1.2　動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黑)2017004，體質(zhì)量(200±20)g，實(shí)驗(yàn)前正常飲食、飲水飼養(yǎng)1周。

1.3　實(shí)驗(yàn)器材

液相色譜儀(Waters公司)；質(zhì)譜儀(Waters公司)；色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18 1.7 μm 2.1×50 mm；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限中佳分公司)；電子分析天平Mettler-Toledo Instruments(其林貝爾儀器制造有限公司)；G-6805電針治療儀(上海醫(yī)療器械廠)；0.30 mm×1.3 cm針灸針(上海醫(yī)療器械廠)。

2　方法

2.1　供試品溶液的制備

乙醇溶液的配置：配置6%(v/v)乙醇的水溶液；α-萘異硫氰酸酯(ANIT)供試液的配置：將4.8 gα-萘異硫氰酸酯(ANIT)樣品，均勻混合于120 mL橄欖油中, 制備4%濃度的α-萘異硫氰酸酯(ANIT)供試液。

2.2　造模

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組后，分籠飼養(yǎng)，自由食水，同等條件下飼養(yǎng)3天。30只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：空白組、模型組和針刺組?？瞻捉M：自由進(jìn)食、飲水，連續(xù)28天。模型組：每天給予6%(v/v)乙醇的水溶液，并作為飲水的惟一來源。自由進(jìn)食28天[4]。于第26天灌胃給予α-異硫氰酸萘酯(ANIT)7.5 mg/100 g，于第27天灌胃給予α-異硫氰酸萘酯(ANIT)2.5 mg/100 g[5-6]。

針刺組:于第29天將酒疸證模型大鼠固定，按照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》的方法[7]，選取G-6805電針治療儀、0.30 mm×1.3 cm針灸針，通電針刺雙側(cè)足三里，頻率2 Hz，深度0.4 cm，治療時(shí)間40 min，電流刺激強(qiáng)度以大鼠大腿輕度抖動(dòng)為度，急性電針1次，慢性6次。共治療7天。

2.3　樣品采集和制備

收集實(shí)驗(yàn)過程中每只大鼠每天的尿液，連續(xù)35天。每次取樣后進(jìn)行離心處理，離心溫度設(shè)置在4℃，離心處理5 min后過濾膜備試。用1%戊巴比妥鈉0.15 mL/100 g腹腔注射麻醉，肝門靜脈取血后置肝素鈉管中，4℃、3 000 rpm的條件下離心15 min，取上清液，血清按照相應(yīng)試劑盒測(cè)定方法，分別測(cè)定TG、CHO、TBIL、TBA。

2.4　色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLCTMBEHC18column(50 mm×2.1 mm id,1.7 μm,WatersCorp,Milford,USA)；流速：0.40 ml·min-1；柱溫：45℃；流動(dòng)相A:0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B:0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序見表1。二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描，紫外檢測(cè)器流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)。

表1　梯度洗脫程序

2.5　質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI),采用正離子模式檢測(cè)；脫溶劑氣流量為600 L·h-1,脫溶劑氣溫度為300℃，霧化氣流量為100 L·h-1，離子源溫度為110℃，毛細(xì)管電壓為3 200 V，錐孔電壓為35 V，微通道板電壓為2 300 V，碰撞能為3 V。每0.14 s采集1次譜圖；準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用亮氨酸-腦啡肽(Leucine-enkephalin，[M+H]+=556.277 1)溶液。質(zhì)量掃描范圍：m/z100-900。以Centriod模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

2.6　分析數(shù)據(jù)

3　結(jié)果

3.1　各組大鼠相關(guān)生化指標(biāo)的比較

模型組與空白組相比TG、CHO、TBIL、TBA含量明顯升高，有顯著差異(P<0.01)，造模因素對(duì)大鼠脂代謝、膽紅素代謝和膽汁酸代謝產(chǎn)生了影響。結(jié)果表明乙醇、α-萘異硫氰酸酯(ANIT)兩因素復(fù)合酒疸證大鼠模型造模成功。針刺組與模型組相比TG、CHO、TBIL、TBA含量明顯下降，有顯著差異(P<0.01)。結(jié)果表明，低頻電針足三里對(duì)酒疸證大鼠模型有治療作用。見表2。

表2　各組大鼠TG、CHO、TBIL、TBA指數(shù)的比較

注：與空白組比較,*P<0.01;與模型組比較,▲P<0.01

3.2　大鼠尿液代謝組學(xué)分析

3.2.1優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣量以0.40 mL/min的流速，在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，分離效果良好,見圖1。

圖1　正離子模式下空白組大鼠尿液BPI輪廓圖

3.2.2針刺組與模型組差異性代謝產(chǎn)物的確定疾病的病理變化對(duì)應(yīng)著體內(nèi)生物體代謝輪廓的改變，通過對(duì)比針刺組與模型組大鼠尿液中代謝成分的變化，找到能夠標(biāo)識(shí)代謝主要差異點(diǎn)的物質(zhì)，從而為佐證治

療的效果和治療的機(jī)制提供客觀的體內(nèi)代謝依據(jù)。如圖2所示尿液BPI輪廓發(fā)生了明顯的變化，說明其低分子量代謝物組的質(zhì)或量不同，到針刺的最后1天這種差異達(dá)到最大值，可從代謝組學(xué)的角度佐證低頻電針足三里對(duì)酒疸證大鼠模型的治療作用。

圖2　針刺組與模型組實(shí)驗(yàn)最后1天尿液代謝產(chǎn)物正離子模式UPLC/TOF-MS BPI輪廓注:A模型組;B針刺組

采用代謝組學(xué)的方法，將對(duì)離散程度貢獻(xiàn)最大的離子進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和代謝途徑鑒定，并確定為差異性代謝產(chǎn)物。通過采用TOF/MS的方法測(cè)定標(biāo)記物的精確質(zhì)量，得到測(cè)定誤差范圍內(nèi)的相應(yīng)化合物的元素組成和相應(yīng)化合物不飽和度；通過分子式或分子質(zhì)量檢索化合物數(shù)據(jù)庫，得到可能的化合物結(jié)構(gòu)，再結(jié)合MS/MS數(shù)據(jù)篩選出一種或幾種化合物，最終通過與對(duì)照品對(duì)比色譜保留行為以及MS/MS數(shù)據(jù)確立了4個(gè)差異性尿液代謝產(chǎn)物。見表3。

表3　離子名稱結(jié)構(gòu)式表

4　討論

代謝組學(xué)技術(shù)具備分辨率高、靈敏度高、檢測(cè)指標(biāo)動(dòng)態(tài)等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)Ⅲw內(nèi)差異性代謝產(chǎn)物的變化通過數(shù)據(jù)的形式全景的展現(xiàn)出來，與中醫(yī)學(xué)的整體觀思想不謀而合。代謝組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)證候動(dòng)物模型建立的應(yīng)用彌補(bǔ)了現(xiàn)代藥理學(xué)檢測(cè)指標(biāo)的靜止和片面等不足[8-9]。通過研究發(fā)現(xiàn)，低頻電針刺酒疸證模型大鼠足三里，對(duì)動(dòng)物機(jī)體的糖代謝、腸道菌群代謝產(chǎn)生了影響。

低頻電針足三里后產(chǎn)生了差異性代謝產(chǎn)物對(duì)甲酚葡萄糖苷酸和2-苯乙醇葡萄糖醛酸苷,這兩種物質(zhì)都是體內(nèi)糖代謝的產(chǎn)物。人體的消化系統(tǒng)參與糖代謝的全過程，糖代謝的紊亂可以間接影響蛋白和脂肪的代謝與合成的過程，從而影響能量的供應(yīng)。臨床上酒疸證的患者會(huì)出現(xiàn)體內(nèi)糖代謝的紊亂和能量供應(yīng)障礙。低頻電針足三里可能從調(diào)節(jié)人體糖代謝的角度，改善酒疸證患者的生理和心理狀態(tài)[10]。

由腸道微生物代謝產(chǎn)生N-甲基-1-萘甲胺和氧化N-甲基-1-萘甲胺代謝產(chǎn)物，再經(jīng)尿液排出。腸道微生物對(duì)膽堿的利用不足可能使體內(nèi)的膽堿來源不足，從而引發(fā)PC的合成減少，直接導(dǎo)致極低密度脂蛋白(VLDL)的合成不足，而后者是三脂酰甘油(TG)運(yùn)輸?shù)礁瓮獾闹饕d體，從而使TG在肝內(nèi)堆積，導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生。針刺足三里產(chǎn)生的腸道微生物代謝產(chǎn)物，降低了三脂酰甘油(TG)的含量，近而影響人體消化系統(tǒng)的功能。

足三里是胃經(jīng)合穴，具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)機(jī)體功能的作用, 對(duì)中醫(yī)酒疸證有良好的治療作用。脾胃為后天之本,水谷生化之源,通過針灸足三里可以調(diào)理足陽明胃經(jīng)功能而強(qiáng)健全身。本研究用代謝組學(xué)的方法確證低頻電針足三里對(duì)酒疸證模型大鼠的治療作用，并鑒定了4個(gè)差異性尿液成分，從而為針灸治療酒疸的有效性提供實(shí)踐的依據(jù)和理論的來源。