大鼠門靜脈系統(tǒng)血栓形成模型的建立和觀察

張津瑜，陳文顯，沈華，王雁，張國雷，慎華平，吳萬波，魏云海

（湖州市中心醫(yī)院 1. 普通外科 2. 超聲科，浙江 湖州 313000）

門靜脈血栓（portal vein thrombosis，PVT）是指門靜脈主干及其左右分支或腸系膜上靜脈、脾靜脈、腸系膜下靜脈形成的血栓，是一種深部血管阻塞性病變[1]。PVT在健康人群中的發(fā)病率很低，被認為是一種少見疾病，然而其在肝硬化患者中的發(fā)病率則高達10%～26%[2-4]。PVT的存在嚴重威脅著肝硬化患者的生命，如胃食管靜脈曲張破裂出血和急性腸缺血，或可加重門靜脈高壓導致反復的上消化道出血、頑固性腹水，甚至肝腎綜合征，進而影響患者的生存率[5-7]。而且有研究[8-10]表明PVT的存在還會增加肝移植手術的難度及移植后患者的病死率。動物模型是研究人體內PVT形成的發(fā)病機制、病程進展和評價治療方法等的重要平臺，門靜脈血栓動物模型的建立由于過程比較復雜，建模成功率較低等因素，國內外對于PVT動物模型建立的研究相對較少，筆者通過間斷結扎阻斷門靜脈的方法成功地建立了穩(wěn)定的PVT大鼠模型，同時對建模前后血栓形成相關指標進行觀察研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級SD大鼠90只，雄性；體質量300～400 g，平均（350±27）g；鼠齡6～8個月。大鼠飼養(yǎng)于湖州市中心醫(yī)院中心實驗室動物房，室溫22～25 ℃，動物房通風良好，每天給予標準化飼料喂養(yǎng)，大鼠自由飲食，90只大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為實驗組和對照組，每組各45只，兩組大鼠分別按以下操作步驟建立模型。

1.2 PVT模型的建立

實驗組：⑴ 術前禁食12 h，使用5%水合氯醛麻醉（0.7 mL/100 g），取仰臥位固定于手術臺上，備皮，常規(guī)碘伏消毒，酒精脫碘。⑵ 沿腹前正中線做縱行切口，長度約5 cm，逐層打開腹腔，首先尋找腸系膜上靜脈，循腸系膜上靜脈向上，可見門靜脈。⑶ 分離門靜脈，取4-0號縫合線分別于門靜脈遠近兩端穿過，將硬膜外導管與靜脈平行放置，結扎遠近兩端（靜脈和硬膜外導管一起結扎），結扎的間距始終為1.5 cm，每隔5 min將結扎線打開1次，恢復門靜脈的血流，共反復操作5次。如此造成該段門靜脈血流滯緩及靜脈壁的損傷，然后關閉腹腔并逐層縫合腹壁（圖1）。對照組：手術步驟同實驗組前兩個步驟，即僅做門靜脈的游離，不做門靜脈的反復結扎。

1.3 標本的獲取及觀察

于術前30 min、手術后30 min及3、6、12、24 h各時間段先由1名經驗豐富的B超科醫(yī)生利用血管超聲多普勒觀察兩組門靜脈血栓形成情況，并測量門靜脈血栓的長度，然后分別采集各時間段兩組大鼠的靜脈血，并測量靜脈血中P-選擇素、D-二聚體及纖維蛋白原含量。血管超聲儀器采用Philips lu-22，探頭型號為L12-5，超聲頻率設置為11 M，血流夾角＜60°。P-選擇素含量測定采用美國Coulter流式細胞儀（試劑盒購于美國Beckman Coulter公司）進行測定，D-二聚體含量測定采用免疫比濁法（試劑盒購于上海希森美康醫(yī)用電子有限公司），采用凝固法檢測標本中纖維蛋白原的含量，上述指標測定均按試劑盒要求操作。于手術24 h后處死兩組所有大鼠，肉眼觀察兩組大鼠門靜脈血栓形成情況，將血栓標本用10%甲醛溶液固定，制成石蠟切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察組織病理學改變。

圖1 實驗組大鼠門靜脈的游離及間斷結扎阻斷情況Figure 1 The isolation and repeated interruption of the portal vein in rats in experimental group

1.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s），兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以率或構成比較[n（%）]表示，采用χ2檢驗比較兩組間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組大鼠PVT建模成功率的比較

實驗組大鼠在建模過程中死亡5只，其中1只死于DIC，2只死于肝衰竭，2只死于急性腸壞死，6只大鼠24 h后未形成門靜脈血栓，34只大鼠在術后24 h后形成穩(wěn)定的PVT，建模成功率為75.56%，對照組大鼠死亡2只，1只死于門靜脈損傷出血，1只死于麻醉過量，3只大鼠手術24 h后僅形成少量附壁血栓，余大鼠未見門靜脈血栓形成，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 實驗組與對照組血栓形成情況比較[n=45，n（%）]Table 1 Comparison of the thrombosis formations between experimental group and control group [n=45, n (%)]

2.2 實驗組大鼠在建模過程中PVT形成的具體情況

實驗組大鼠術前30 min、術后30 min及3 h血管超聲均未見門靜脈血栓形成，CDFI血流充盈良好，流速正常（圖2A-C）；10只大鼠建模6 h后血管超聲可見PVT開始形成，CDFI血流充盈缺損，流速增大（圖2D）；18只大鼠建模12 h后血管超聲可見PVT，部分大鼠PVT較前增大，CDFI血流充盈缺損，流速增大（圖2E）；34只大鼠術后24 h后血管超聲可見PVT形成，部分大鼠PVT進一步增大，CDFI血流充盈缺損較前明顯，血流速度進一步增大（圖2F）。

術后24 h處死大鼠，肉眼可見形成血栓的大鼠門靜脈有穩(wěn)定黑色血栓形成，門靜脈可允許部分血流通過，呈半狹窄狀態(tài)，測量血栓的長度與血管彩超測量的血栓長度基本一致，使用注射器針頭輕輕穿刺可見血栓的血管壁，血管壁變硬，無出血，提示血栓為穩(wěn)定的黑色血栓（圖3）。

病理學檢查在顯微鏡下可見門靜脈血栓機化伴新生血管形成及炎癥細胞浸潤，并可見多核巨噬細胞（圖4）。

2.3 兩組大鼠各時間段血栓形成相關指標的比較

兩組大鼠P-選擇素、D-二聚體及纖維蛋白原含量在術前與術后30 min及術后3 h差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），但在術后6 h后各時間段差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖5）。

圖2 實驗組大鼠建模前后各時間段門靜脈系統(tǒng)血管超聲表現(xiàn) A：術前30 min；B：術后30 min；C：術后3 h；D：術后6 h；E：術后 12 h；F：術后 24 hFigure 2 Vascular ultrasonography of portal vein system of rats in the experimental group at various time points A: Preoperative 30 min; B: Postoperative 30 min; C: Postoperative 3 h; D: Postoperative 6 h; E: Postoperative 12 h; F: Postoperative 24 h

圖3 實驗組大鼠術后24 h后PVT形成情況Figure 3 The PVT formation in rats in experimental group 24 h after operation

圖4 實驗組大鼠門靜脈系統(tǒng)血栓形成的病理學表現(xiàn) A：HE×40；B：HE×100Figure 4 The pathological fi ndings of portal vein thrombosis of rats in experimental group A: HE×40; B: HE×100

圖5 不同時間點兩組血栓形成相關指標含量變化 注：1）與對照組比較，P＜0.05 Figure 5 Changes in the thrombosis-associated variables in the two groups at diあ erent time points Note: 1) P＜0.05 vs. control group

2.4 實驗組大鼠各時間段血栓長度變化情況

實驗組大鼠在手術前、后30 min及手術后3 h未見明顯門靜脈血栓形成，手術后6 h超聲可見門靜脈系統(tǒng)血栓形成，長度為（5.25±1.33）mm，術后12 h門靜脈血栓長度為（9.21±1.07）mm，術后24 h門靜脈血栓長度為（13.76±1.02）mm，且術后24 h超聲測量的血栓長度基本與處死大鼠后肉眼測量的血栓長度一致。

3 討 論

PVT是在1868年被Balfour首次發(fā)現(xiàn)并報道的，雖然目前的研究表明，其在正常健康人群當中的發(fā)病率極低[2]，但其在肝硬化患者尤其是肝硬化失代償期患者中較常發(fā)生，同時PVT也是肝硬化門靜脈高壓患者針對脾功能亢進及食管胃底靜脈曲張破裂出血行脾臟切除聯(lián)合血管斷流術后最嚴重的并發(fā)癥之一，嚴重威脅著患者的生命[11-12]。評估PVT的嚴重程度主要包括血栓的程度（部分血栓、完全血栓和纖維條索形成），血栓的分期（急性、慢性和門靜脈海綿樣變）和血栓的范圍[13-14]。PVT的病情越嚴重，則患者的預后就會越差。動物模型是用來研究各種疾病發(fā)生、發(fā)展、治療效果、疾病結局等方面的常用手段，但由于門靜脈系統(tǒng)解剖的特殊性，給成功建立門靜脈血栓動物模型造成了很大的困難，因此，尋找一種可行的且符合臨床要求的門靜脈血栓動物模型的建立方法至關重要。

根據(jù)Virchow提出的靜脈血栓形成的三因素，即靜脈血流滯緩、靜脈壁損傷、以及局部凝血功能增高，制備靜脈血栓的動物模型至少需要滿足上述條件之一，誘發(fā)血栓形成的方法主要有阻斷法、結扎法、異物法、內膜損傷法及血栓誘導劑法等多種方法。制備靜脈血栓常用的動物有大鼠、小鼠、兔、豬、犬、猴等[15]。Wei等[16]采用注入氯化鐵及凝血酶的方法成功制備了鼠的顱內靜脈竇血栓模型。Kai等[17]采用經皮經肝穿刺損傷靜脈壁的方法成功制備了豬腸系膜血管的靜脈血栓模型。雖然像兔、豬、猴等大動物的生理結構可能更加接近人類的生理特點，但使用大動物制備動物模型費用頗高，而且常受倫理方面的約束，其應用受到了一定的限制。而像大鼠、小鼠等小型動物則可以很好的解決上述的問題[18]。國內外雖有采用大小鼠制備深靜脈血栓動物模型的報道，但其主要以下肢深靜脈為主，門靜脈血栓模型報道較少，造模成功率較低。

本研究通過間斷結扎阻斷門靜脈使結扎段門靜脈局部血流滯緩，同時可以造成結扎處門靜脈壁的損傷，從而誘發(fā)門靜脈血栓的形成。本文筆者認為，采用這種方法制作動物模型具有以下特點：一是在造模過程中，結扎門靜脈時將門靜脈與硬膜外導管同時結扎，既可以確保結扎段的門靜脈的長度始終保持一致及每次結扎門靜脈的力度基本相同，排除了因結扎力度及結扎段長度不同對實驗結果造成的干擾，同時此方法不僅可以造成門靜脈局部血流瘀滯，還可以造成結扎處門靜脈壁的損傷，造模成功率高，本研究達75.56%，此外該方法操作簡單，可重復性較高；二是采用此方法制備血栓模型比較接近人體內血栓形成的生理特點，同時動物模型形成的血栓其形態(tài)學與人體內血栓相似，更具有研究價值。但制備該模型同時需要注意幾個方面，首先分離門靜脈及其周圍組織時，動作一定要輕柔，避免損傷甚至離斷門靜脈，造成建模的失?。黄浯我獓栏窨刂坡樽韯┑挠昧?，以免麻醉過量造成大鼠死亡，采血時動作要輕柔，避免大鼠窒息；最重要的是要掌握好結扎門靜脈時的力度及打開結扎線的時間，避免造成門靜脈的阻斷時間過長及靜脈壁損傷過度。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)深靜脈血栓患者體內存在血小板激活。研究認為，P-選擇素是血小板活化標志物之一，其可通過介導血小板、內皮細胞黏附及白細胞的相互作用，參與啟動血栓形成的病理生理起始過程，是血栓形成的重要介質及靶分子[19-20]。D-二聚體是已交聯(lián)纖維蛋白的降解產物之一，其在血漿中的水平代表了體內凝血酶原的活性及纖維蛋白原的生成情況，是人體內血栓形成的重要指標之一[21-22]。纖維蛋白原是血漿中含量最高的凝血因子，一直以來被當做預測血栓和血栓形成的獨立危險因素，其在血漿中的含量增高，可以改變血液粘度及血液流變學指標，而后兩者的改變又與血管內皮細胞損傷及血栓形成等多種效應有關[23-24]。本研究結果顯示，實驗組與對照組大鼠在術前、術后30 min及術后3 h，P-選擇素、D-二聚體及纖維蛋白原水平差異無統(tǒng)計學意義，但在術后6 h后各時間段上述指標差異有統(tǒng)計學意義，說明P-選擇素、D-二聚體及纖維蛋白原水平在血栓形成后均有所增高，且與未形成血栓時的含量有明顯差異，其可作為是否有血栓形成的重要參考指標，這與某些研究的結論相似[25]。

綜上所述，采用間斷結扎阻斷門靜脈的方法建立門靜脈血栓大鼠模型是可行的，且建模成功率較高，P-選擇素含量、D-二聚體含量及纖維蛋白原含量可以作為是否有血栓形成的重要參考指標。當然，本研究也存在一些不足，實驗者只研究了從建模開始到形成穩(wěn)定的門靜脈血栓這個過程，對于之后門靜脈血栓是否可能再通及血栓相關指標進一步的變化情況，并未做進一步的研究，期望在接下來的研究中可以進一步去探索。

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