基于氧傳感技術(shù)測(cè)定煙草種子活力的初步研究

　，　，　　，　，　

(玉溪中煙種子有限責(zé)任公司，　云南 玉溪 653100)

種子活力是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)[1-4]，高活力種子具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和生產(chǎn)潛力，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有十分重要的意義。目前，ISTA(國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì))推薦的種子活力檢測(cè)方法[5-8]主要有：幼苗分級(jí)法、幼苗生長(zhǎng)速率測(cè)定、加速老化法、抗冷測(cè)定法、磚礫法、四唑法等。這些方法有的耗時(shí)、費(fèi)錢(qián)、費(fèi)力，有的要求操作者具有豐富經(jīng)驗(yàn)，在實(shí)際應(yīng)用中均受到一定限制。對(duì)于煙草種子，其活力主要是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)的發(fā)芽率來(lái)判定[9-10]，但發(fā)芽試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，結(jié)果與田間實(shí)際出苗相關(guān)性低[11-12]，隨著煙區(qū)對(duì)煙草種子質(zhì)量要求的逐步提高[13-14]，該法越來(lái)越不能滿足快速、精確檢測(cè)煙草種子質(zhì)量的需求。隨著信息技術(shù)與生物技術(shù)的發(fā)展，人們期待一種精確、快速、自動(dòng)化的種子活力測(cè)定方法。

Q 2氧傳感技術(shù)是荷蘭ASTEC公司發(fā)展的一種高效、自動(dòng)、精確檢測(cè)種子活力的新方法[15-17]，其檢測(cè)原理是通過(guò)監(jiān)測(cè)種子萌發(fā)過(guò)程中的呼吸耗氧情況來(lái)判定種子的活力。細(xì)胞的呼吸作用是各生物組織新陳代謝的基本能量來(lái)源，低活力種子細(xì)胞組織的呼吸活力弱，且在吸脹時(shí)呼吸體系的自我修復(fù)能力差，萌發(fā)需要更長(zhǎng)時(shí)間的呼吸作用；高活力的種子呼吸活力強(qiáng)，萌發(fā)需要較短時(shí)間呼吸作用。目前，Q 2氧傳感技術(shù)已應(yīng)用于甜菜、番茄、玉米、水稻、林木種子的活力檢測(cè)[18-20]，且效果較好，而其在煙草種子活力檢測(cè)方面的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道，因此，研究將利用Q 2氧傳感技術(shù)檢測(cè)不同生產(chǎn)年份、不同密度、不同催芽工藝煙草種子的氧傳感指標(biāo)，并分析該技術(shù)在煙草種子活力測(cè)定方面的應(yīng)用效果。

1　材料與方法

1.1　材　料

所有試驗(yàn)種子均來(lái)自玉溪中煙種子有限責(zé)任公司。

不同生產(chǎn)年份煙草種子為玉溪中煙種子公司18 ℃下保存的庫(kù)存裸種，具體品種和生產(chǎn)年份如下：云煙85(1997年)、云煙85(2009年)、云煙87(2001年)、MS云煙87(2014年)、K 326(1996年)、MSK 326(2013年)、TN 90(2001年)、TN 90(2009年)。

不同密度煙草種子為2014—2015年度玉溪中煙種子有限責(zé)任公司西雙版納冬繁基地良繁生產(chǎn)的云煙105裸種經(jīng)不同密度液體介質(zhì)分選后所得。分選過(guò)程如下：采收云煙105成熟蒴果，經(jīng)干燥脫粒、風(fēng)選、篩選后去除種皮、雜質(zhì)，將干凈種子倒入2～3倍體積的密度為0.8 g/mL的正己烷和氯仿的混合溶液，種子分為上下2層，分離后得到上、中層密度≤0.8 g/mL的種子和下層密度>0.8 g/mL種子，舍棄上、中層種子，下層種子則倒入2～3倍體積的密度為0.9 g/mL正己烷和氯仿的混合溶液，分離后得到上層0.8 g/mL<密度≤0.9 g/mL的種子和下層密度>0.9 g/mL的種子，重復(fù)以上步驟，利用不同密度的正己烷和氯仿組成的液體有機(jī)介質(zhì)的浮力，將種子分成0.8～0.9 g/mL、0.9～1.0 g/mL、1.0～1.1 g/mL、1.1～1.2 g/mL等不同的密度區(qū)間，然后檢測(cè)各個(gè)密度區(qū)間種子的呼吸代謝、發(fā)芽、出苗情況。

不同催芽工藝處理的煙草種子為玉溪中煙種子有限責(zé)任公司庫(kù)存良種。催芽工藝如下：選擇同一批號(hào)MS云煙85、MSK 326、云煙97種子，分別放入清水、50 mg/L的GA3溶液當(dāng)中，浸種3 h，加入6 g/L的CuSO4溶液消毒0.5 h，排出消毒液，清水清洗種子，再次加入50 mg/L的GA3溶液催芽引發(fā)20 h，取出種子，鋪為薄層，自然風(fēng)干至含水量低于10%，干燥后種子進(jìn)行呼吸代謝、發(fā)芽、出苗檢測(cè)。

1.2　方　法

1.2.1種子呼吸代謝分析

在96孔板的各個(gè)小孔(515μL)中加入500μL濃度為0.5%的瓊脂溶液，待瓊脂凝固后，每個(gè)小孔內(nèi)放入1粒待測(cè)裸種，覆蓋帶有熒光材料的塑料薄膜于板上，加熱至塑料薄膜緊緊密封每個(gè)小孔。將密封后96孔板置于Q 2氧傳活力分析儀上，保持室內(nèi)溫度為25 ℃，設(shè)置檢測(cè)時(shí)間為180 h，檢測(cè)間隔時(shí)間為0.5 h，啟動(dòng)儀器，開(kāi)始檢測(cè)種子萌發(fā)過(guò)程呼吸耗氧情況。

根據(jù)每次測(cè)量記錄的氧氣濃度和時(shí)間繪制的耗氧曲線，由系統(tǒng)自帶的ANS軟件分析耗氧曲線，得到煙草種子萌發(fā)過(guò)程呼吸代謝指標(biāo)：增加代謝時(shí)間(IMT)、氧代謝率(OMR)、臨界氧氣壓力(COP)、相對(duì)發(fā)芽時(shí)間(RGT)、同質(zhì)性(HOM)。

IMT(Increased Metabolism Time)表示氧氣消耗速率從初始的緩慢速度開(kāi)始增加的時(shí)間，單位為小時(shí)，反映了種子吸脹萌動(dòng)至胚根突破種皮的快慢。高活力的種子在短時(shí)間內(nèi)吸脹萌動(dòng)，胚根突破種皮，IMT值低。

OMR(Oxygen Metabolism Rate)是種子胚根突破種皮后到受低氧脅迫氧氣消耗速率變慢之間的呼吸速率，單位是百分比氧氣濃度每小時(shí)，反映了種子萌發(fā)過(guò)程的代謝活動(dòng)強(qiáng)弱。高活力的種子經(jīng)過(guò)吸脹萌動(dòng)后，細(xì)胞器發(fā)育良好，細(xì)胞膜自我修復(fù)充分，生物酶活力強(qiáng)，代謝旺盛，表現(xiàn)為OMR值高。

COP(Critical Oxygen Pressure)是呼吸速率開(kāi)始減速時(shí)氧氣百分比濃度，單位為百分比氧氣濃度。由于種子萌發(fā)過(guò)程處于密閉試管中，當(dāng)試管中氧氣濃度降低到一定水平時(shí)，種子萌發(fā)處于低氧脅迫狀態(tài)，種子呼吸速率降低。因此，COP值反映了種子耐低氧脅迫的能力。

RGT(Relative Germination Time)為非低氧脅迫條件下的理論萌發(fā)時(shí)間，是斜線延長(zhǎng)至x軸的交點(diǎn)，單位為小時(shí)。由于這是假設(shè)在非低氧脅迫條件下氧氣消耗到零時(shí)的推斷時(shí)間，因此RGT值跟每個(gè)種子的實(shí)際萌發(fā)時(shí)間直接相關(guān)。

HOM(Homogeneity)表示理論萌發(fā)時(shí)間分布差異的大小，用來(lái)指示種子萌發(fā)或出苗均勻一致的程度。

1.2.2發(fā)芽指標(biāo)檢測(cè)

在培養(yǎng)皿中墊2層濕潤(rùn)濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻放置100粒種子，加蓋，每個(gè)樣品3次重復(fù)，種子置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，25 ℃下每天光照12 h，發(fā)芽期間保持濾紙濕潤(rùn)。每天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽情況至第7天，取3次重復(fù)的平均值。

發(fā)芽勢(shì)：萌發(fā)第5天的發(fā)芽率；

發(fā)芽率：萌發(fā)第7天的發(fā)芽率；

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt(式中：Gt為第t天的發(fā)芽種子數(shù)；Dt為發(fā)芽天數(shù))。

1.2.3出苗率檢測(cè)

使用20×10孔的育苗盤(pán)進(jìn)行漂浮育苗，每個(gè)批號(hào)種子2次重復(fù)，15 d統(tǒng)計(jì)種子出苗率，取2次平均值。

1.2.4相關(guān)性分析

采用SPSS 17.0軟件分析IMT、OMR、COP、RGT、HOM與種子出苗率之間的相關(guān)顯著性和相關(guān)系數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同生產(chǎn)年份煙草種子的氧傳感指標(biāo)、發(fā)芽指標(biāo)與出苗率的關(guān)系

由圖1可以看出，25 ℃下不同品種、不同生產(chǎn)年份煙草種子在吸水萌發(fā)的前60 h耗氧曲線斜率較小，說(shuō)明種子呼吸作用較弱，氧氣消耗速率較低，種子應(yīng)處于吸脹至胚根突破種皮階段；60～100 h，種子呼吸作用增強(qiáng)，呼吸速率大幅提高，氧氣含量急劇降低，該階段煙草種子胚根突破種子，快速伸長(zhǎng)，子葉開(kāi)始突破種皮甚至展開(kāi)，需要快速呼吸作用為萌發(fā)提供大量能量；萌發(fā)100 h后，種子處于低氧環(huán)境，雖然萌發(fā)仍需要較高能量供應(yīng)，但受低氧脅迫影響，呼吸作用逐漸降低，直至氧氣消耗完畢。

由表1可以看出，對(duì)于云煙85、云煙87(MS云煙87)、K 326(MSK 326)、TN 90不同生產(chǎn)年份種子，同一品種年份越長(zhǎng)，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)越低。從相關(guān)性來(lái)看，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、OMR均與出苗率呈正相關(guān)，而IMT、COP、RGT、HOM與出苗率呈負(fù)相關(guān)。其中，OMR值即種子氧代速率與出苗率相關(guān)性最高，在0.01水平呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.847，而IMT值即萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間與出苗率在0.05水平呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.728，這2個(gè)指標(biāo)比使用傳統(tǒng)發(fā)芽指標(biāo)如發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)來(lái)反映種子實(shí)際出苗情況相關(guān)性更好，更能反映種子活力。

表1不同生產(chǎn)年份煙草種子呼吸代謝指標(biāo)與發(fā)芽指標(biāo)

品種生產(chǎn)年份含水量(%)發(fā)芽勢(shì)(%)發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)IMT(h)OMR(%/h)COP(%)RGT(h)HOM出苗率(%)云煙8519973.2577.784.720.4955.041.7430.9135.2126.792.5云煙8520093.3493.794.723.3952.21.9228.9111.216.5594.0云煙8720013.4682.391.021.6359.061.6231.2166.3184.581.5MS云煙8720143.0494.798.023.7449.081.7329.1243.5104495K32619963.2660.381.316.8359.231.6230.4134.431.0383.5MSK32620133.5197.098.324.3952.661.8828.4114.519.6798.5TN9020013.5573.389.021.6152.51.6525.711295.584.5TN9020093.5282.091.320.4655.11.6826.7150.2317.589.5相關(guān)系數(shù)r0.6920.6120.674-0.728?0.847??-0.1-0.075-0.207

注：“*”在0.05水平顯著相關(guān)，“**”在0.01水平呈顯著相關(guān)。下同。

表2不同密度煙草種子呼吸代謝指標(biāo)與發(fā)芽指標(biāo)

品種密度區(qū)間含水量(%)5d發(fā)芽勢(shì)(%)7d發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)IMT(h)OMR(%/h)COP(%)RGT(h)HOM出苗率(%)云煙1050.8<ρ ≤ 0.93.511.348.78.950.51.8739.41995728247.80.9<ρ ≤ 1.03.745.384.015.846.31.9237.1312116748.51.0<ρ ≤ 1.13.180.790.719.743.92.0537.0236.6841521.1<ρ ≤ 1.23.798.398.623.840.712.3631.45101.524.6764相關(guān)系數(shù)r0.8270.6820.837-0.8670.994??-0.969?-0.551-0.59

圖1　不同生產(chǎn)年份煙草種子呼吸代謝平均曲線

2.2　不同密度煙草種子呼吸代謝指標(biāo)、發(fā)芽指標(biāo)與出苗率的關(guān)系

利用Q 2氧傳感技術(shù)分析了云煙105不同密度煙草種子呼吸代謝情況，發(fā)現(xiàn)密度越高，種子OMR值越高，呼吸速率越快，萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間越短，發(fā)芽質(zhì)量越好，尤其是密度區(qū)間在1.0～1.1 g/mL、1.1～1.2 g/mL種子OMR最高，這與種子發(fā)芽結(jié)果以及漂浮育苗出苗結(jié)果一致，即隨著種子密度的提高，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、出苗率等都逐漸提高，種子活力增加。而通過(guò)相關(guān)性分析可知，OMR與種子出苗率在0.01水平呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.994，COP與出苗率在0.05水平呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.969，而發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)與出苗率的相關(guān)系數(shù)分別為0.827、0.682、0.837，均未達(dá)到顯著相關(guān)。

2.3　不同催芽工藝煙草呼吸代謝指標(biāo)、發(fā)芽指標(biāo)與出苗率的關(guān)系

從發(fā)芽指標(biāo)來(lái)看，3個(gè)品種種子經(jīng)GA3浸種和清水浸種處理發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均差異極小，與出苗率的相關(guān)性也極低，種子活力基本無(wú)法區(qū)分。從呼吸代謝指標(biāo)來(lái)看，MS云煙85、云煙97的種子經(jīng)GA3浸種比經(jīng)清水浸種處理的OMR值有所提高，但提升幅度不大，說(shuō)明種子呼吸速率略有提高，而HOM值都大幅降低，說(shuō)明種子萌發(fā)更加整齊；而MSK 326種子情況相反，經(jīng)GA3浸種與經(jīng)清水浸種比較，OMR值卻略有降低，說(shuō)明種子本身活力較高，GA3浸種處理反而影響了其活力，這與出苗率對(duì)應(yīng)結(jié)果一致。比較各個(gè)呼吸代謝指標(biāo)、發(fā)芽指標(biāo)與出苗率的相關(guān)性，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、IMT相關(guān)性正負(fù)出現(xiàn)問(wèn)題，不能正確反映種子出苗情況；而發(fā)芽勢(shì)、OMR、COP、RGT、HOM仍能正確指示種子出苗情況，其中以O(shè)MR值相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)為0.566。

表3不同處理煙草種子呼吸代謝ASTEC值與發(fā)芽指標(biāo)

品種浸種方式含水量(%)5d發(fā)芽勢(shì)(%)7d發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)IMT(h)OMR(%/h)COP(%)RGT(h)HOM出苗率(%)MS云煙85清水3.2596.798.024.3037.741.5533.55126.5074.5345.5GA33.3996.09724.1644.111.9231.84104.4026.2562.0MSK326清水3.7997.79824.4444.652.0129.66100.416.6963.5GA33.5096.096.724.2143.291.8832.62120.494.1347.06云煙97清水3.3999.399.724.8444.321.4334.37270.2124545.5GA34.3398.799.324.746.021.6435.34129.438.7664.5相關(guān)系數(shù)r0.072-0.04-0.10.6260.566-0.31-0.537-0.52

3　討論與結(jié)論

1) 利用Q 2氧傳感技術(shù)分析了不同生產(chǎn)年份、不同密度、不同催芽工藝處理煙草種子萌發(fā)過(guò)程中的呼吸代謝情況，種子呼吸代謝指標(biāo)尤其是OMR值即氧代速率能夠較好的評(píng)價(jià)煙草種子的活力。對(duì)不同生產(chǎn)年份、不同密度種子，OMR值與出苗率在0.01水平呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.847、0.994；對(duì)不同催芽工藝處理煙草種子，OMR值與出苗率相關(guān)系數(shù)為0.566。

2) 對(duì)于不同生產(chǎn)年份、不同密度、不同催芽工藝處理煙草種子，利用Q 2氧傳感技術(shù)提供的呼吸代謝指標(biāo)來(lái)指示煙草種子活力比利用傳統(tǒng)發(fā)芽指標(biāo)效果更好，與種子實(shí)際出苗率相關(guān)性更高。