玉蟬花愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生研究

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(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，　黑龍江 哈爾濱 150040)

鳶尾屬(Iris)植物種類豐富，可根據(jù)其營養(yǎng)器官的不同將其分為兩大類群,即球根鳶尾(BulbousIrises)和根莖鳶尾(RhizomatousIrises)[1]。其作為觀賞花卉應(yīng)用較廣范，可用做園林綠化材料[2-6]，也可以做切花應(yīng)用[7-9]。

鳶尾屬植物通過無性繁殖和有性繁殖均可，其中無性繁殖技術(shù)中最常用的是分株繁殖，分株繁殖能夠很好的保持植物的優(yōu)良性征，而且成活率較高、繁殖速度較快，被廣泛地應(yīng)用；而無性繁殖中的組織培養(yǎng)快繁是非常有效的實現(xiàn)資源保護的方法，該方法比分株繁殖要快幾百倍[10]，近些年不斷有不同種鳶尾的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究報導(dǎo)。在鳶尾屬植物中，不同種在組培快繁外植體的選擇上存在明顯差異[11-14]，其中愈傷途徑的再生體系研究中常用外植體有莖尖[15-16]、嫩葉[17]、花莖[18]、花瓣[19]等。但是，以花器官為外植體的取材不僅受到季節(jié)限制，還受株齡限制(鳶尾屬植物多數(shù)種類2年才開花；相比之下，以莖尖和嫩葉作為誘導(dǎo)愈傷的外植體，取材方便、消毒容易，是鳶尾屬植物組培快繁最常用的外植體材料。

玉蟬花(IrisensataThunb.)是鳶尾屬中的根莖類花卉，性喜水濕，也適應(yīng)旱生環(huán)境，耐寒性較強，是我國東北地區(qū)比較珍貴的夏花類、紫色大花野生觀賞花卉資源。目前玉蟬花在我國并沒有得到很好的開發(fā)利用，而且隨著濕地開墾和環(huán)境的破壞，野生資源受到極大的破壞，數(shù)量越來越少，有效的快繁技術(shù)研究對于資源有效保護基礎(chǔ)上的開發(fā)利用十分重要。目前，對玉蟬花的研究工作主要集中在開花生物學(xué)[20]、種子萌發(fā)特性[21]、種質(zhì)超低溫保存[22-23]、種胚[24]及花器官[25]直接誘導(dǎo)不定芽再生體系的建立等方面。隨著鳶尾屬植物生物工程育種的開展，玉蟬花愈傷途徑再生體系的建立也是構(gòu)建植物基因遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)，因此高誘導(dǎo)率的愈傷途徑的再生體系建立也尤為重要。本試驗在前期通過種胚獲得無菌叢生芽的基礎(chǔ)上[24]，嘗試?yán)闷錈o菌莖尖和嫩葉研究其愈傷組織的誘導(dǎo)及再分化，進一步完善玉蟬花植株再生體系，為資源有效開發(fā)利用及其轉(zhuǎn)基因工程育種提供材料。

1　試驗材料和方法

1.1　試驗材料

本試驗將玉蟬花(IrisensataThunb.)的種子消毒后(種子于2015年9月采摘自東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實驗基地，在室內(nèi)陰干保存)切取種胚誘導(dǎo)萌發(fā)得到實生苗，于無菌條件下培養(yǎng)1個月后獲得叢生芽[24]，選取叢生芽上單個生長健壯的組培苗莖尖及葉片為外植體材料。

1.2　試驗方法

1.2.1外植體處理

莖尖處理，選擇健壯的無菌組培苗進行無菌操作，先剪掉距植株根基部1 cm上的葉片，用刀片切去基部外層組織及外層葉片(保留莖頂端2～3片葉)，在解剖鏡下用解剖針將外植體的剩余葉片去掉(注意保留莖尖組織的完整性)，切取約2 mm3的莖尖備用。

葉片處理，在超凈工作臺內(nèi)用消毒的刀片將組培苗的外層葉片切掉，將其內(nèi)層嫩葉(莖頂端起第4～6片葉)切成0.5 cm2的塊狀備用。

1.2.2誘導(dǎo)愈傷組織

試驗選用MS培養(yǎng)基，加入6.0 g/L的瓊脂粉和30 g/L的蔗糖作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA、NAA和2,4-D，調(diào)pH值5.8，進行L9(34)正交試驗(見表1)。每個處理分別接種20個外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)室的培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光照強度25μmol/(m2·s)，光照時間14 h/d(培養(yǎng)條件下同)。

1.2.3不定芽的分化

試驗選用MS培養(yǎng)基，加入6.0 g/L的瓊脂粉和30 g/L的蔗糖作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA、NAA和KT，調(diào)pH值5.8，進行L9(34)正交試驗(見表3)。每個培養(yǎng)基配方中接種20個約0.5 cm3的愈傷團，重復(fù)3次。

1.2.4生根培養(yǎng)

從叢生芽中選取單個生長旺盛的不定芽，接種于生根培養(yǎng)基上(見表5)，每個處理接種20株苗，重復(fù)3次，觀察并統(tǒng)計其生根的情況。

1.3　數(shù)據(jù)處理分析[14,24]

誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)形成愈傷組織的外植體個數(shù)/接種外植體個數(shù)×100%;

分化率(%)=誘導(dǎo)分化出不定芽的愈傷數(shù)量/接種愈傷數(shù)×100%；

平均分化不定芽數(shù)=愈傷分化產(chǎn)生的不定芽總數(shù)/接種的愈傷組織總塊數(shù);

生根率(%)=生根的不定芽數(shù)/接種不定芽的總數(shù)×100%；

生根數(shù)=苗生根總數(shù)/接種不定芽的總數(shù)。

采用Excel軟件對原始數(shù)據(jù)進行整理，SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，包括多重比較分析(Duncan’s)和方差分析及顯著性檢驗。

2　結(jié)果與分析

2.1　玉蟬花不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果

由表1可知，以莖尖為外植體除了A 1號培養(yǎng)基未能誘導(dǎo)出愈傷組織外，其余各處理都能誘導(dǎo)出愈傷組織；以嫩葉作為外植體時，各處理均未能成功誘導(dǎo)出愈傷組織，說明玉蟬花的莖尖適合作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織。

表1不同培養(yǎng)基處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

處理6-BA 濃度(mg/L)NAA濃度(mg/L)2,4-D濃度(mg/L)誘導(dǎo)率(%)A10.50.21.00.00±0.00gA20.50.52.511.11±1.28fA30.51.02.029.63±1.96cdA41.00.22.034.07±1.96cA51.00.51.051.51±2.92aA61.01.02.543.70±3.23bA72.00.22.524.45±2.22dA82.00.52.08.15±0.74fA92.01.01.017.78±3.39e

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±SD。同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。

2.2　不同培養(yǎng)基處理對愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果

由表1可見，6-BA、NAA、2,4-D 3種激素不同濃度的組合對玉蟬花莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)起到良好的作用，各處理間愈傷組織的獲得率差異顯著。經(jīng)過約40 d的培養(yǎng)，A 5號培養(yǎng)基平均誘導(dǎo)率達(dá)到51.51%，顯著高于其他處理，其表面干燥且顆粒性明顯呈黃色，生長狀態(tài)良好。通過比較各因素的Ⅲ型平方和(見表2)，確定影響莖尖愈傷組織誘導(dǎo)的激素條件由大到小順序為6-BA>NAA>2,4-D，從誘導(dǎo)結(jié)果可看出，低濃度(0.5 mg/L)和高濃度(2.0 mg/L)的6-BA組合均不利于愈傷組織的誘導(dǎo)，A 1處理外植體直接形成苗而未能誘導(dǎo)出愈傷組織，可能與激素配比有關(guān)。綜合試驗結(jié)果，從中選出玉蟬花莖尖誘導(dǎo)愈傷組織較優(yōu)的培養(yǎng)基組合為MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.5 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L，誘導(dǎo)率為(51.51±2.92)%。

表2不同培養(yǎng)基處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響的單因素方差分析

因素Ⅲ型平方和自由度df均方MSF值p值6-BA1424.2312712.1163.1480.241NAA191.760295.8800.4240.7022,4-D33.025216.5130.0730.932

2.3　不同培養(yǎng)基處理對愈傷分化不定芽的結(jié)果

對莖尖誘導(dǎo)出的愈傷組織進行增殖繼代培養(yǎng)30 d，取生長狀態(tài)良好的約0.5 cm3的愈傷團，在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d時統(tǒng)計不定芽誘導(dǎo)情況，不同處理均能分化出不定芽(見表3)，其中B 5組合愈傷組織平均分化率最高，達(dá)72.31%，平均分化不定芽數(shù)為5.81，與其它處理差異顯著，不定芽顏色深綠、生長粗壯。通過比較各因素的Ⅲ型平方和(見表4)，確定影響愈傷組織分化不定芽的激素條件由大到小順序為6-BA>NAA>KT，低濃度6-BA(0.5 mg/L)不利于愈傷組織誘導(dǎo)不定芽；濃度為0.5 mg/L的NAA有利于不定芽的誘導(dǎo)。綜合比較篩選出較優(yōu)培養(yǎng)基組合為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 1.0 mg/L。

表3不同培養(yǎng)基處理對愈傷分化不定芽的影響

處理6-BA濃度(mg/L)NAA濃度(mg/L)KT濃度(mg/L)分化率(%)平均分化不定芽數(shù) B10.50.01.016.32±2.23g1.50±0.14dB20.50.53.044.35±3.06de1.73±0.15dB30.51.02.038.86±1.82e2.62±0.24cB41.00.02.050.00±0.00cd3.45±0.17bcB51.00.51.072.31±1.93a5.81±0.16aB61.01.03.061.20±2.69b5.12±0.06aB72.00.03.027.78±4.04f1.35±0.20dB82.00.52.038.89±2.25e3.67±0.39bB92.01.01.055.55±2.92bc4.12±0.15b

2.4　不同培養(yǎng)基處理對不定芽誘導(dǎo)生根的影響

誘導(dǎo)出的不定芽均采用莊春慧[24]的方法，以最佳增殖培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L+KT 2.0 mg/L)進行增殖培養(yǎng)，選擇生長高約5 cm健壯的不定芽叢，切取不定芽進行生根誘導(dǎo)。培養(yǎng)7 d左右可以看到，在不定芽的基部出現(xiàn)白色生根點，培養(yǎng)至20 d時根粗壯且密集。由表5可以看出，各處理間有一定的差異，其中C 2和C 3組合不定芽生根率達(dá)到100.00%，平均生根數(shù)分別為7.33、9.80；C 4處理雖然生根數(shù)顯著高于其它處理，但生根率不高，僅為79.00%，與C 2和C 3結(jié)果相比差異顯著；綜合比較選擇出較優(yōu)的生根培養(yǎng)基為：MS+NAA 1.5 mg/L。

表4不同培養(yǎng)基處理對愈傷分化不定芽的影響的單因素方差分析

因素Ⅲ型平方和自由度df均方MSF值p值6-BA1258.2162629.1086.4730.134NAA839.9542419.9774.3210.188KT46.534223.2670.2390.807

表5不同培養(yǎng)基處理對不定芽生根的影響

處理NAA濃度(mg/L)生根率(%)生根數(shù)根粗(mm)C10.587.17±4.04b7.67±0.63b0.97±0.07cC21.0100.00±0.00a7.33±0.52b1.73±0.04bC31.5100.00±0.00a9.80±0.38a2.48±0.05aC42.079.00±3.05b10.00±0.58a1.80±0.11b

本試驗中接種的莖尖外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上經(jīng)約40 d誘導(dǎo)形成愈傷組織，在分化培養(yǎng)基的作用下約30 d誘導(dǎo)形成不定芽，在分化培養(yǎng)基上繼續(xù)繼代培養(yǎng)60 d，將生長健壯的芽分離出來進行生根誘導(dǎo)，生根苗按照莊春慧等[24]的方法進行移栽(見圖1)，成活率在85%左右。

3　討　論

以往研究發(fā)現(xiàn)，激素在鳶尾屬植物組織培養(yǎng)過程中對細(xì)胞的分化起到了重要的調(diào)節(jié)作用，其莖尖愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基的激素種類和濃度又因種不同而存在一定差異；已有的研究中鳶尾屬植物的莖尖誘導(dǎo)愈傷的誘導(dǎo)率、不定芽分化率都不高。如西伯利亞鳶尾(Irissibirica)莖尖的愈傷誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+KT 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L,誘導(dǎo)率為62.37%，不定芽分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，分化率為60.24%[16]；雜種鳶尾(Irishybrids)莖尖的愈傷誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，不定芽分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L[26]。本研究中，玉蟬花莖尖為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L，最高誘導(dǎo)率為51.51%,不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 1.0 mg/L，分化率為72.31%；而Boltenkov等[27-28]以玉蟬花離體的胚胎組織誘導(dǎo)愈傷組織，最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+KT 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L，不定芽分化培養(yǎng)基為MS+KT1.0 mg/L+IAA 2.0 mg/L，獲得了較高的誘導(dǎo)率(90%)和分化率(75%)，這可能與不同外植體器官自身的分生能力有關(guān)。鳶尾屬植物有一些種類以花莖為外植體的誘導(dǎo)分化率通常較高[19]，但王文元等以玉蟬花的2個品種Irisensata‘Rose Frappe’和Irisensata‘Hougyoku’ 的花莖為外植體進行愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽的分化研究，結(jié)果表明，平均誘導(dǎo)率也僅50.09%，不定芽分化率也僅為50%[18]。本研究過程中獲得的愈傷多數(shù)較松軟或呈水漬狀，一般情況下這不利于愈傷的增殖與分化，王杰等[29]對麝香百合的這種愈傷組織狀態(tài)進行調(diào)整，通過在培養(yǎng)基中添加0.05μmol/L氯化鈷和60 g/L蔗糖并在光照條件下進行愈傷培養(yǎng)，對其胚性愈傷組織的比例和顆粒性都有較好的改善，從而促進了愈傷的增殖與分化。今后可以借鑒以往研究經(jīng)驗，通過調(diào)整玉蟬花愈傷的生長狀態(tài)，進一步提高愈傷的分化率。玉蟬花莖尖愈傷誘導(dǎo)及植株再生體系成功的建立，進一步完善了玉蟬花植株多途徑的再生體系，可以更有效的促進優(yōu)質(zhì)野生資源繁殖開發(fā)利用，也滿足了基因工程育種的材料需求。

注：A～C為愈傷誘導(dǎo)；D為愈傷分化不定芽；E為誘導(dǎo)30 d所得不定芽；F為從生芽；G為叢生芽誘導(dǎo)生根；H為移栽20 d的植株。圖1　玉蟬花愈傷組織誘導(dǎo)不同階段的培養(yǎng)情況

在本試驗中，以嫩葉為外植體未能實現(xiàn)愈傷組織的誘導(dǎo)，但同屬的短旗鳶尾(Irispumila)卻通過嫩葉誘導(dǎo)獲得了愈傷[17]，今后可以進一步通過激素的調(diào)整來研究玉蟬花嫩葉的愈傷途徑再生體系。

研究過程中發(fā)現(xiàn)，玉蟬花不定芽誘導(dǎo)生根時受培養(yǎng)基中NAA激素濃度的影響，當(dāng)培養(yǎng)基中僅加入NAA(0.5,1.0,1.5 mg/L)時，在一定濃度范圍內(nèi)不定芽的生根率及生根系數(shù)會隨著NAA濃度升高而升高，根多且粗壯，組培苗長勢良好，但當(dāng)濃度達(dá)到2.0 mg/L時對生根起到一定的抑制作用，生根率降低。