人工老化處理對不同休眠特性水稻種子生理特性的影響

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(1.湖州市農(nóng)業(yè)局農(nóng)作物技術(shù)推廣站，　浙江 湖州 313000；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室，　杭州 311300；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所，浙江農(nóng)科種業(yè)有限公司，　杭州 310021)

糧食儲備是糧食安全的重要環(huán)節(jié)[1]，稻谷儲藏過程中米質(zhì)劣變、發(fā)芽率下降一直是困擾生產(chǎn)、儲運和經(jīng)營部分而又難以克服的問題[2]，由此造成我國每年糧食儲藏損失高達350億kg。種子的耐貯性影響糧食儲備，因此研究水稻種子的耐貯性尤為重要。種子耐貯性的研究方法主要有自然老化法和人工加速老化法。種子老化是種子活力在生理成熟期達到最高后開始出現(xiàn)不可逆的自然衰退[3]。種子老化可引起種子體內(nèi)貯藏物質(zhì)下降[4]，有毒物質(zhì)積累[5]，細胞結(jié)構(gòu)破壞，生理代謝紊亂，從而嚴重影響種子的耐貯性和種子活力[6]。董國軍等認為，自然老化非常緩慢，難以在較短時間內(nèi)測定種子活力，在品種改良中進行耐儲藏種質(zhì)篩選時難以應(yīng)用[7]。而Ellis等認為，在-13～80 ℃對種子進行處理，種子的老化規(guī)律是一致的[8]。因此，用人工加速老化方法模擬自然老化已成為研究種子耐貯性的通用方法。

在雜交水稻制種過程中，通過選育具有強休眠性的保持系和不育系可以解決雜交稻制種穗發(fā)芽的危害，延長種子的儲藏時間。侯雅杰認為，休眠種子能通過長時間儲藏而保持活力，適應(yīng)性較強[9]。但也有學(xué)者認為，休眠性強的種子可能會影響種子的萌發(fā)，并不一定更耐儲藏[10]。種子休眠性和耐藏性之間的關(guān)系研究較少，仍不明確。本研究采用高溫高濕人工加速老化方法，對2個具有休眠特性差異的水稻品種及其雜交F2代種子進行老化處理，研究老化對不同休眠特性差異水稻種子生理特性的影響，以期揭示水稻種子休眠性與耐藏性的關(guān)系，為耐貯性水稻品種選育提供理論參考。

1　材料與方法

1.1　材　料

供試材料為秈稻品種4 K 58(Ⅱ-32 B休眠)、4 K 59(Ⅱ-32 B)、C 178和C 179的種子。4 K 58種子具有休眠性；C 178和C 179分別是4 K 58和4 K 59與不育系(Ⅱ-32 A)雜交獲得的F2代種子。

采用人工加速老化方法對供試材料進行處理：100%RH，40 ℃，老化3，6，9 d。老化結(jié)束后將種子放在室溫下晾干24 h，用紙袋包裝，4 ℃保存?zhèn)溆?。以未老化種子為對照(ck)。

1.2　方　法

1.2.1種子丙二醛含量測定

分別將不同老化天數(shù)處理的種子均勻置于濕潤的濾紙上吸脹24 h[11]，參照Cao等[12]的方法測定丙二醛(MDA)的含量。稱取0.15 g的吸脹種子樣品，加入4 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.8)進行研磨，然后在10 000 r/min條件下離心15 min。取1.5 mL上清液，加入2.5 mL 5%(w/v)硫代巴比妥酸-三氯乙酸溶液?；旌先芤涸?00 ℃下煮沸15 min，然后迅速冷卻。以1 800 r/min離心10 min后，測定上清液在532 nm和600 nm下的吸光度值。采用155 mM-1cm-1消光系數(shù)計算MDA的含量。

1.2.2種子抗氧化物酶活性測定

分別將不同老化天數(shù)處理的種子均勻置于濕潤的濾紙上吸脹24 h，稱取0.15 g的吸脹種子樣品，加入4 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.8)進行研磨，然后在10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液作為測定酶活性的粗酶液[13]。根據(jù)Hu等[13]的方法，通過監(jiān)測H2O2在240 nm下吸光度值的降低來測定過氧化氫酶(CAT)的活性。反應(yīng)液包括2.8 mL 25 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.0，含2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2))，100μL 300 mmol/L H2O2和100μL粗酶提取液。參照Nakano等[14]的方法，通過監(jiān)測反應(yīng)液在290 nm下吸光度值的降低來檢測抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性，3 mL混合液中含有2.7 mL 25 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.0，含2 mmol/L EDTANa2)、100μL 300 mmol/L H2O2和100μL粗酶提取液。根據(jù)Guan等[15]的方法，通過測定1 min內(nèi)反應(yīng)液在470 nm下吸光度值的增加來測定過氧化物酶(POD)活性。反應(yīng)液含有2.7 mL 25 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.0，含2 mmol/L EDTANa2)、100μL 1.5%愈創(chuàng)木酚、100μL 300 mmol/L H2O2和100μL粗酶提取液。根據(jù)Xu等[16]的方法測定超氧化物歧化酶(SOD)的活性。在560 nm下，以抑制NBT光化還原反應(yīng)50%時的酶量作為一個酶活性單位，計算總的SOD活性。

1.3　統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)用SAS進行統(tǒng)計分析，多重比較采用最小顯著差法(LSD)，α=0.05，百分率數(shù)據(jù)在分析前進行反正弦轉(zhuǎn)換(y=arcsin[sqrt (x/100)])。

2　結(jié)　果

2.1　不同老化時間處理對種子MDA含量的影響

未經(jīng)老化處理的種子(ck)中，C 178和C 179的MDA含量均顯著高于4 K 58和4 K 59；C 178和C 179之間，4 K 58和4 K 59之間均無顯著差異。種子老化3 d后，C 178種子的MDA含量顯著高于4 K 58和4 K 59，后兩者之間無顯著差異。C 178和C 179之間也無顯著差異。種子老化6 d后，4 K 59種子的MDA含量顯著低于其余3個品種，3個品種之間無顯著差異。種子老化9 d后，C 178種子的MDA含量顯著高于其余3個品種，C 179種子的MDA含量顯著高于4 K 58和4 K 59，4 K 58和4 K 59之間無顯著差異。

表1不同水稻品種老化處理后種子MDA含量比較

品種老化天數(shù)(d)cka3694K58C7.4±0.31bBC8.5±0.36bcB9.7±0.57abA11.7±0.64c4K59C6.2±0.52bBC8.0±0.46cB9.1±0.48bA11.8±0.87cC178B9.8±0.45aB10.1±0.36aB10.8±0.31aA16.7±0.89aC179B8.9±0.46aB9.7±0.26abB9.7±0.34abA14.3±0.11b

注：cka是指未經(jīng)老化處理的種子。數(shù)值后小寫字母表示不同水稻品種經(jīng)相同老化天數(shù)處理后的種子MDA含量差異顯著性；數(shù)值前大寫字母表示同一水稻品種經(jīng)不同老化天數(shù)處理后的種子MDA含量差異顯著性(LSD，α=0.05)。

隨老化處理時間延長，4個品種種子MDA含量均呈逐漸上升趨勢。老化9 d后，4個品種種子MDA含量均顯著高于老化6 d。老化6 d后，4個品種種子MDA含量與老化3 d無顯著差異，但4 K 58和4 K 59的種子MDA含量均顯著高于ck。老化3 d后，4個品種中種子MDA含量與ck無顯著差異。

2.2　不同老化時間處理對種子CAT活性的影響

2.2.1不同老化時間處理對種子CAT活性的影響

未經(jīng)老化處理的種子(ck)中，4 K 58的CAT活性與4 K 59無顯著差異，二者均顯著低于C 178；C 178的CAT活性顯著低于C 179。種子老化3 d后，4 K 58種子的CAT活性顯著低于4 K 59，4 K 59則顯著低于C 178，C 178的CAT活性顯著低于C 179。種子老化6 d后，4 K 58種子的CAT活性顯著低于4 K 59；4 K 59與C 178之間無顯著差異，但二者均顯著低于C 179。種子老化9 d后，4個品種種子的CAT活性變與同老化3 d一致。

注：ck是指未經(jīng)老化處理的種子。柱形圖上方小寫字母表示不同水稻品種經(jīng)相同老化天數(shù)處理后的種子CAT活性差異顯著性；大寫字母表示同一水稻品種經(jīng)不同老化天數(shù)處理后的種子CAT活性差異顯著性(LSD，α=0.05)。圖1　不同水稻品種老化處理后種子的CAT活性

隨老化時間的延長，4個品種種子的CAT活性均呈下降趨勢。老化3 d后，4個品種種子的CAT活性均顯著低于ck。老化6 d后，4 K 58和4 K 59種子的CAT活性與老化3 d無顯著差異；C 178和C 179的CAT活性均顯著低于老化3 d。老化9 d后，4 K 58和4 K 59種子的CAT活性均顯著低于老化6 d；C 178和C 179的CAT活性與老化6 d無顯著差異。

2.2.2不同老化時間處理對種子APX活性的影響

未老化的4 K 58種子APX活性顯著低于4 K 59，4 K 59則顯著低于C 178，C 178的APX活性顯著低于C 179。種子分別老化3 d和6 d后，4個品種種子的APX活性變化與未老化處理一致。種子老化9 d后，4 K 58種子的APX活性顯著低于4 K 59；4 K 59與C 178之間無顯著差異，二者均顯著低于C 179。

注：ck是指未經(jīng)老化處理的種子。柱形圖上方小寫字母表示不同水稻品種經(jīng)相同老化天數(shù)處理后的種子APX活性差異顯著性；大寫字母表示同一水稻品種經(jīng)不同老化天數(shù)處理后的種子APX活性差異顯著性(LSD，α=0.05)。圖2　不同水稻品種老化處理后種子的APX活性

隨老化時間的延長，4個品種種子的APX活性均呈下降趨勢。除C 179之外，未老化處理的其余3個品種種子APX活性均顯著高于老化3 d的種子。老化6 d后，4 K 58和4 K 59種子的APX活性與老化3 d無顯著差異；C 178和C 179的APX活性均顯著低于老化3 d。老化9 d后，除4 K 59之外，其余3個品種種子APX活性均顯著低于老化6 d。

2.2.3不同老化時間處理對種子POD活性的影響

未老化處理的種子中，4 K 59的POD活性顯著高于其余3個品種；4 K 58顯著高于C 178和C 179；后兩者之間無顯著差異。種子老化3 d后，4 K 59種子的POD活性顯著高于其余3個品種，4 K 58顯著高于C 179，C 179顯著高于C 178。種子老化6 d后，4個品種種子的POD活性變化與老化3 d一致。種子老化9 d后，4個品種種子的POD活性變化與未老化處理(ck)一致。

隨老化時間的延長，4個品種種子的POD活性均呈下降趨勢。種子老化3 d后，4 K 58和4 K 59的種子POD活性與未老化處理(ck)無顯著差異，C 178和C 179種子的POD活性均顯著低于ck。種子老化6 d后，4 K 59和C 178的POD活性顯著低于老化3 d，4 K 58和C 179與老化3 d無顯著差異。種子老化9 d后，除4 K 59的POD活性與老化6 d無顯著差異外，其余3個品種均顯著低于老化6 d。

注：ck是指未經(jīng)老化處理的種子。柱形圖上方小寫字母表示不同水稻品種經(jīng)相同老化天數(shù)處理后的種子POD活性差異顯著性；大寫字母表示同一水稻品種經(jīng)不同老化天數(shù)處理后的種子POD活性差異顯著性(LSD，α=0.05)。圖3　不同水稻品種老化處理后種子的POD活性

2.2.4不同老化時間處理對種子SOD活性的影響

未老化的4 K 58種子SOD活性顯著低于4 K 59，4 K 59顯著低于C 178和C 179，C 178和C 179之間無顯著差異。種子老化3 d后，4個品種種子的SOD活性變化與ck一致。種子老化6 d后，4 K 58的SOD活性顯著低于其余3個品種，后三者之間無顯著差異。種子老化9 d后，4 K 58的SOD活性顯著低于C 178，C 178顯著低于4 K 59，4 K 59顯著低于C 179。

注：ck是指未經(jīng)老化處理的種子。柱形圖上方小寫字母表示不同水稻品種經(jīng)相同老化天數(shù)處理后的種子SOD活性差異顯著性；大寫字母表示同一水稻品種經(jīng)不同老化天數(shù)處理后的種子SOD活性差異顯著性(LSD，α=0.05)。圖4　不同水稻品種老化處理后種子的SOD活性

隨老化時間的延長，除4 K 59種子的SOD活性無顯著變化外，其余3個品種種子的SOD活性均呈下降趨勢。種子老化3 d后，3個品種種子的SOD活性與未老化處理無顯著差異。種子老化6 d后，C 178的SOD活性顯著低于老化3 d，其余2個品種與老化3 d無顯著差異。種子老化9 d后，4 K 58和C 178的SOD活性顯著低于老化6 d。

3　討　論

種子老化是作物種子貯藏過程中普遍存在的一種自然現(xiàn)象。在種子老化過程中，其內(nèi)部會發(fā)生一系列的生理生化變化，包括膜完整性的破壞和膜的自動氧化，種子內(nèi)酶活性變化，有毒物質(zhì)積累，種子的合成修復(fù)能力降低等[17]。本研究采用人工加速老化方法對2個具有休眠特性差異的秈稻品種及其各自與不育系的雜交F2代種子進行老化處理，發(fā)現(xiàn)所有種子經(jīng)老化處理后劣變程度加深，表現(xiàn)為MDA含量顯著上升，抗氧化物酶(SOD、POD、CAT和APX)活性均下降等，且不同品種間存在顯著差異。

MDA通常作為脂質(zhì)過氧化指標，其含量在一定程度上可以反映膜脂質(zhì)過氧化水平[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，4個水稻品種種子隨老化時間的延長，MDA含量均呈現(xiàn)顯著上升的趨勢，說明老化引起脂質(zhì)過氧化作用加強，這與小麥[19]、糯玉米[20]和高粱[21]等種子研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在所有處理中，2個自交系種子(4 K 58和4 K 59)的MDA含量均顯著低于2個雜交種(C 178和C 179)，這可能與雜交水稻種子比常規(guī)稻(自交系)種子不耐貯藏有關(guān)[22]。雜交稻種子具有的遺傳特性使其米粒組織疏松，閉穎較差，保護性能下降，易受外界因素影響，不利于貯藏；同時，雜交稻種子生理代謝旺盛，呼吸強度比常規(guī)稻更大，也使得其貯藏穩(wěn)定性較差[23]。休眠特性差異對老化后種子的MDA含量有一定影響，但不顯著，僅在老化9 d后的C 178種子中，發(fā)現(xiàn)其MDA含量顯著高于C 179。

種子老化的另一個重要表現(xiàn)為種子體內(nèi)抗氧化物酶類活性的下降。李春雷等對人工老化處理的玉米種子活力指標和生理指標進行了研究，發(fā)現(xiàn)種子活力與過氧化物酶、過氧化氫酶、脫氫酶活性的相關(guān)系數(shù)達到顯著或極顯著水平，能很好地預(yù)測種子活力水平[4]。因此，研究種子老化過程中抗氧化物酶活性的變化對于了解種子活力及劣變程度具有重要參考價值。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著老化時間的延長，4個水稻品種種子的抗氧化物酶活性均呈下降趨勢，尤其是CAT、APX和POD 3種酶。這些結(jié)果與前人在玉米[4]、桔梗[11]和小麥[24]等種子的研究結(jié)果一致。類似的，在所有處理中，2個自交系種子的SOD、CAT和APX活性均顯著低于2個雜交種，這進一步驗證了雜交稻種子生理代謝比常規(guī)稻更旺盛，呼吸強度更大[22-23]。但需注意的是，2個自交系種子的POD活性卻顯著高于2個雜交種，這可能與水稻品種或抗氧化物酶的類別不同有關(guān)。種子的休眠特性差異對抗氧化物酶活性的影響顯著：在所有處理中，4 K 58種子的抗氧化物酶(SOD、CAT、APX和POD)活性均顯著低于4 K 59；同樣，由4 K 58和不育系的雜交F2代種子(C 178)，其抗氧化物酶活性也低于C 179。另外，結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，隨老化時間的延長，4 K 58和C 178種子的SOD、APX和POD活性下降程度均分別較4 K 59和C 179更為劇烈。由于種子的抗氧化物酶活性與種子活力水平呈顯著正相關(guān)[4,25]，表明具有休眠特性的水稻種子也不耐貯藏。

綜上，經(jīng)人工加速老化處理后，4個水稻品種種子內(nèi)MDA含量隨老化時間延長而顯著增加，抗氧化物酶活性逐漸下降；表明老化處理顯著抑制了種子體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的活性，加深了膜脂過氧化程度，引發(fā)或加劇了種子的劣變。雜交F2代種子的MDA含量和抗氧化物酶活性均顯著高于自交系種子，證明雜交稻種子比常規(guī)稻種子更不耐貯藏。此外，由于4 K 58和C 178種子的抗氧化物酶活性均分別低于4 K 59和C 179，推測具有休眠性的水稻種子更不耐貯藏。