不同種類及不同配比的激素和碳源對(duì)大麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響

　，　，　，　　，　

(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，　天津 300384)

世界谷類作物中，大麥的種植總面積和總產(chǎn)量?jī)H次于小麥、水稻、玉米而居第4位，是重要的農(nóng)作物。通過(guò)組織培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)大麥愈傷組織，分化出新的植株，是大麥轉(zhuǎn)基因、抗逆性等諸多研究的基礎(chǔ)。而在幾種禾本科作物中，大麥組織培養(yǎng)的研究略晚，目前仍處于再生體系的建立和完善階段[1]。建立大麥再生體系首先需要高效誘導(dǎo)大麥愈傷組織。郭曉琳[2]利用大麥成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，但是誘導(dǎo)率低，質(zhì)量較差，大部分品種難以再生。閆永榮研究表明，大麥幼胚具有較快的生長(zhǎng)速度和較佳的生理狀態(tài)，是獲得再生植株最有效的外植體[3]。本研究采用大麥Morex的幼胚作為實(shí)驗(yàn)材料，分析不同2,4-D濃度及不同碳源(蔗糖、葡萄糖、麥芽糖)對(duì)大麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及不同濃度配比的6-BA/IAA對(duì)誘導(dǎo)出的愈傷分化的影響，為建立高效大麥再生體系和后期各項(xiàng)大麥研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材　料

大麥Morex幼胚。

1.2　方　法

1.2.1培養(yǎng)基

誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基①：MS+20 g/L蔗糖+10 g/L麥芽糖+2,4-D+6.5 g/L瓊脂(pH=5.8)，不同2,4-D濃度梯度見(jiàn)表1。

表1大麥Morex幼胚愈傷誘導(dǎo)的不同2,4-D濃度

激素濃度(mg/L)2,4-D234567

誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基②：MS+碳源+6 mg/L 2,4-D+6.5 g/L瓊脂(pH=5.8)，不同碳源濃度梯度見(jiàn)表2。

表2大麥Morex幼胚愈傷誘導(dǎo)的碳源種類及濃度

碳源濃度(g/L)蔗糖2030405060葡萄糖2030405060蔗糖+麥芽糖10+1020+1030+1040+1050+10

分化培養(yǎng)基：MS+40 g/L 蔗糖+6-BA/IAA+6.5 g/L瓊脂(pH=5.8)，不同6-BA與IAA濃度配比見(jiàn)表3。

表3大麥Morex幼胚愈傷分化激素配比

激素濃度(mg/L)6-BA/IAA0.5/0.11.0/0.11.5/0.12.0/0.13/0.16-BA/IAA0.5/0.21.0/0.21.5/0.22.0/0.23/0.2

1.2.2材料處理

將幼嫩的大麥種子浸泡在蒸餾水中，在無(wú)菌操作臺(tái)中，用75%的酒精處理30 s，無(wú)菌水洗凈，再用10%的次氯酸鈉處理30 min，無(wú)菌水洗5次，每次3 min。將大麥種子放在無(wú)菌培養(yǎng)皿中用無(wú)菌解剖針擠出幼胚后縱切，接入培養(yǎng)基中，每瓶接種6個(gè)縱切胚，每個(gè)處理接種20瓶，3次重復(fù)。放入培養(yǎng)室黑暗培養(yǎng)15 d進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.3繼代與分化培養(yǎng)

按照上述步驟方法，計(jì)算得出湖南省2001～2015年各個(gè)年份的城市化系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)綜合指數(shù)、綜合調(diào)和指數(shù)、耦合度和耦合協(xié)調(diào)度(表3)。綜合評(píng)價(jià)結(jié)果顯示：

將初代愈傷組織每隔20 d進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代3次后，將狀態(tài)良好大小一致的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)。分化培養(yǎng)30 d后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.4培養(yǎng)條件

誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)：25 ℃，暗培養(yǎng)。

分化培養(yǎng)：25 ℃，光照16 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx。

1.2.5統(tǒng)計(jì)方法

誘導(dǎo)率(%)=出愈數(shù)/接種的縱切胚數(shù)×100%；

直接發(fā)芽率(%)=發(fā)芽數(shù)/接種的幼胚數(shù)×100%；

誘導(dǎo)率、分化率的方差分析采用SPPS 24.0的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同濃度的2,4-D對(duì)大麥Morex幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

從表4可以看出，2,4-D濃度為6 mg/L時(shí)，大麥Morex幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)率最高。而且2,4-D濃度為6 mg/L時(shí)標(biāo)準(zhǔn)差和方差較低，說(shuō)明數(shù)據(jù)波動(dòng)小，代表性高。

表4不同濃度的2,4-D對(duì)大麥Morex幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)率

2,4-D濃度(mg/L)平均出愈率(%)標(biāo)準(zhǔn)差方差245.285.09125.919350.828.02664.418455.557.08550.205559.722.0984.405676.112.9308.585766.114.74022.471

2.2　不同濃度的2,4-D對(duì)大麥Morex幼胚愈傷組織直接發(fā)芽率的影響

由圖1可看出，6 mg/L的2,4-D誘導(dǎo)的大麥Morex幼胚愈傷組織較大。統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表5)表明，2,4-D濃度為6 mg/L時(shí)，大麥Morex幼胚的愈傷組織直接發(fā)芽率最低，為7.22%。故選用6 mg/L的2,4-D濃度為不同碳源處理時(shí)的濃度。

表5大麥Morex幼胚在不同2,4-D濃度下的直接發(fā)芽率

2,4-D濃度(mg/L)芽數(shù)(個(gè))直接發(fā)芽率(%)24011.1134211.6743710.2753610.006267.2274713.05

2.3　不同種類及不同濃度碳源對(duì)大麥Morex幼胚出愈率的影響

從表6可看出，在2,4-D濃度為6 g/L的條件下蔗糖濃度為40 g/L時(shí)，大麥Morex幼胚的出愈率最高；蔗糖加麥芽糖為30 g/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率也較高。

注：A為2,4-D濃度為2 mg/L時(shí)的大麥Morex幼胚愈傷組織(15 d)；B為2,4-D濃度為6 mg/L時(shí)的大麥Morex幼胚愈傷組織(15 d)。圖1　大麥幼胚愈傷組織

表8不同濃度的激素配比的大麥Morex幼胚愈傷組織分化率

6-BA/IAA(mg/L)0.5/0.11/0.11.5/0.12/0.13/0.10.5/0.21/0.21.5/0.22/0.23/0.2分化率(%)62788186867754639195

表6不同種類及不同濃度碳源下大麥Morex幼胚的出愈率(%)

碳源20g/L30g/L40g/L50g/L60g/L蔗糖52.3341.6768.6730.6747.33葡萄糖54.3355.6751.6744.3344.67蔗糖+麥芽糖48.6764.0056.3348.6742.33

2.4　不同種類及不同濃度碳源對(duì)大麥Morex幼胚愈傷組織直接發(fā)芽率的影響

從表7可看出，愈傷組織直接發(fā)芽率最低的是葡萄糖濃度為20 g/L時(shí)的培養(yǎng)基；蔗糖濃度為50 g/L時(shí)愈傷組織直接發(fā)芽率最高。其中蔗糖濃度為40 g/L時(shí)，愈傷組織直接發(fā)芽率為11%，相對(duì)濃度為20 g/L和30 g/L較高；但是碳源濃度為20 g/L和30 g/L時(shí)，大麥Morex幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率均較低，因此綜合考慮選40 g/L的蔗糖濃度為碳源。

表7施加不同種類及不同濃度碳源大麥Morex幼胚愈傷組織直接發(fā)芽率(%)

碳源20g/L30g/L40g/L50g/L60g/L蔗糖6.337.0011.0027.6725.00葡萄糖5.6713.0015.6719.6726.67葡萄糖+麥芽糖9.337.6713.6717.6718.33

2.5　不同激素濃度配比對(duì)大麥Morex幼胚愈傷組織分化率的影響

圖2是6-BA與IAA的濃度配比為(3∶0.2)mg/L時(shí)分化30 d后的大麥Morex幼胚愈傷組織；數(shù)據(jù)表明，6-BA與IAA的濃度配比為(3∶0.2)mg/L時(shí)，大麥Morex愈傷組織的分化率最高，其中6-BA的濃度是IAA濃度的20～30倍時(shí)，大麥Morex幼胚愈傷組織的分化率均較高。

圖2　大麥Morex幼胚愈傷組織分化狀態(tài)

3　討論與結(jié)論

3.1　討　論

本試驗(yàn)主要研究培養(yǎng)基成分中碳源及激素對(duì)大麥Morex幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)及分化的影響。結(jié)果表明，大麥Morex幼胚誘導(dǎo)愈傷的最佳2,4-D濃度為6 mg/L；最佳的碳源為蔗糖，其濃度為40 g/L時(shí)誘導(dǎo)率最高；6-BA與IAA的濃度配比為(3∶0.2)mg/L時(shí)，愈傷組織的分化率均最高。影響大麥幼胚誘導(dǎo)愈傷組織和分化的因素有大麥的基因型、培養(yǎng)基的配方、接種方式、幼胚質(zhì)量、幼胚胚齡等[4-5]。其中基因型是幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的主要影響因子[6]，藍(lán)慶、閆永榮等以美里黃金，甘啤4號(hào)，Golden promise等為材料研究大麥再生體系的建立以及轉(zhuǎn)基因工程，他們的研究表明，大麥品種間的出愈率、愈傷組織的分化率均有顯著差異，比如大麥Morex的出愈率高達(dá)94.95%，而短芒紫青稞的出愈率低于6%[7-19]。郭曉琳等的研究表明，種子縱切后接種出愈率顯著高于橫切[10]。因此本研究選用愈傷誘導(dǎo)率最高的大麥Morex的幼胚為材料，并采用縱切的方法將1個(gè)大麥Morex幼胚切成2塊接入培養(yǎng)基。大麥Morex幼胚接種3 d后，愈傷組織開(kāi)始形成，15 d后形成干燥的淡黃色密致愈傷組織。用SPSS 24.0軟件中單因素ANOVA分析不同2,4-D濃度下大麥幼胚出愈率的差異顯著性，分析結(jié)果如表9所示。

表9不同2,4-D濃度下大麥Morex幼胚出愈率的差異顯著

方差分析平方和自由度均方F顯著性組間1832.7655366.55312.4960.000組內(nèi)352.0041229.334總計(jì)2184.76917

結(jié)果表明，大麥Morex幼胚在6種2,4-D濃度水平下的培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率差異性極顯著(α<0.01)，不同濃度2,4-D對(duì)大麥Morex幼胚的愈傷誘導(dǎo)影響極大。任江萍等在大麥幼胚立體培養(yǎng)條件的建立中也提到，不同濃度2,4-D對(duì)大麥愈傷組織的誘導(dǎo)存在較大差異[11]。由圖3可以看出，2,4-D濃度在2～6 mg/L之間時(shí)，出愈率隨2,4-D的濃度升高而升高，2,4-D濃度在5～7 mg/L之間是大麥Morex幼胚愈傷誘導(dǎo)最佳的濃度范圍。與任江萍的研究相比，結(jié)果差異較大，她認(rèn)為2,4-D的濃度在1～2 mg/L時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率較高，當(dāng)由2 mg/L升到5 mg/L時(shí)愈傷誘導(dǎo)率則下降。這可能是大麥品種不同和接種的幼胚胚齡不同而造成的差異。

由圖4可以看出，在2,4-D的濃度為6 mg/L時(shí)，發(fā)芽率最低，綜合最高愈傷誘導(dǎo)率也是6 mg/L的2,4-D條件下誘導(dǎo)的，因此6 mg/L的2,4-D是誘導(dǎo)大麥Morex幼胚愈傷組織的最佳濃度。

圖3　不同2,4-D濃度下的大麥Morex幼胚平均出愈率

圖4　不同2,4-D濃度下的大麥Morex幼胚平均愈傷直接出芽率

圖5　不同種類及不同濃度碳源下大麥Morex幼胚平均出愈率

圖6　不同種類及不同濃度碳源下大麥Morex幼胚平均直接出芽率

表10單樣本檢驗(yàn)

碳源檢驗(yàn)值 = 68.67t自由度顯著性(雙尾)平均值差值差值 95% 置信區(qū)間下限上限蔗糖+麥芽糖-4.46840.011-16.67000-27.0294-6.3106蔗糖-3.27440.031-20.53600-37.9498-3.1222

根據(jù)魏日鳳對(duì)不同碳源對(duì)水稻成熟胚的影響研究表明，蔗糖與麥芽糖的配比對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有重要影響[12]。因此本研究設(shè)計(jì)了葡萄糖、蔗糖和蔗糖與麥芽糖的配比進(jìn)行研究。從圖5可以看出，40 g/L的蔗糖大麥Morex幼胚愈傷誘導(dǎo)率最高，20 g/L蔗糖加10 g/L麥芽糖愈傷誘導(dǎo)率次之。從圖6可以看出，20 g/L的葡萄糖愈傷組織直接出芽率最低，但是其對(duì)應(yīng)的愈傷誘導(dǎo)率也比較低，蔗糖濃度為40 g/L的出芽率相對(duì)居中，20 g/L蔗糖加10 g/L麥芽糖出芽率則比40 g/L的蔗糖低。因此對(duì)20 g/L蔗糖加10 g/L麥芽糖的大麥Morex幼胚愈傷組織平均誘導(dǎo)率與最高的誘導(dǎo)率68.67%作差異顯著性單樣本T檢驗(yàn)分析，結(jié)果如表10 所示。

在單個(gè)樣本檢驗(yàn)表中，顯示了t統(tǒng)計(jì)量為-4.468，自由度DF為4，平均值差值為-16.67，其中t檢驗(yàn)的顯著性0.011小于顯著性水平0.05，說(shuō)明這兩組數(shù)據(jù)存在顯著差異。因此誘導(dǎo)大麥Morex幼胚產(chǎn)生愈傷組織最佳的碳源及濃度為40 g/L的蔗糖。

圖7　不同激素配比下大麥愈傷組織分化率

在愈傷組織分化階段，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例決定了分化的趨向，劉雷等研究發(fā)現(xiàn)，不同比例的ZT和IAA對(duì)愈傷組織分化出綠點(diǎn)的作用差別不明顯[13]，很多研究的細(xì)胞分裂素一般都選用6-BA[14-16]。因此本研究選用的生長(zhǎng)素為IAA，細(xì)胞分裂素為6-BA。圖7為不同濃度的激素配比的大麥Morex愈傷組織分化率，6-BA與IAA的濃度配比為3/0.2時(shí)，大麥Morex幼胚愈傷組織的綠點(diǎn)率最高，其中6-BA的濃度是IAA濃度的20～30倍時(shí)，大麥Morex幼胚愈傷組織的分化率均較高。

3.2　結(jié)　論

本研究結(jié)果表明，大麥Morex幼胚誘導(dǎo)愈傷的最佳2,4-D濃度為6 mg/L；最佳的碳源為40 g/L的蔗糖；6-BA與IAA的濃度配比為(3∶0.2)mg/L時(shí)，愈傷組織的分化率均最高。