EM菌制劑處理對馬鈴薯種薯細胞保護及抗性生理特性的影響

，　，　　，　　，　，　，　，　

(1.東北農(nóng)業(yè)大學，　哈爾濱 150030；　2.遼寧省本溪市農(nóng)業(yè)技術服務中心，　遼寧 本溪 117000)

EM菌制劑是由日本琉球大學的比嘉照夫教授于1982年研究成功的復合活菌劑，為黃褐色、半透明液體，pH值在3.5～4.5之間，含有多種有益微生物[1]。EM菌制劑釆用日本菌種的發(fā)酵技術，利用特殊的發(fā)酵工藝，通過篩選，使菌液中嫌氣性微生物和好氣性微生物共存[2-3]。EM菌用途廣泛、效果顯著，主要應用于農(nóng)業(yè)、畜牧養(yǎng)殖業(yè)和環(huán)境保護等領域。農(nóng)業(yè)方面，EM菌主要有提高作物質(zhì)量產(chǎn)量、減少化肥使用和改良土壤、抑制病蟲害和雜草的作用。田志宏等研究表明，根灌、噴施EM菌制劑與對照相比，馬鈴薯單株薯數(shù)、薯重和小區(qū)產(chǎn)量均顯著增加，增產(chǎn)幅度達8.8%～13.6%，有良好的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益[4]。陳勝利等采用田間小區(qū)試驗法研究EM菌劑對作物生長及生理效應的影響得出，用EM菌劑拌種，土壤中有機質(zhì)、堿解氮、速效、磷速效鉀等各養(yǎng)分物質(zhì)含量均有所增加、酸堿度穩(wěn)定[5]。這是由于菌體在土壤中的一系列活動促使作物生長發(fā)育，對根際土壤的影響也十分明顯，有效促進作物的生長發(fā)育和土壤的培肥[5]。使用EM菌制劑還可以避免大量使用化肥、農(nóng)藥等對人體有害的物質(zhì)，對減少環(huán)境污染,對實施無公害、綠色農(nóng)業(yè)具有促進作用[6]。

馬鈴薯為茄科茄屬一年生草本植物，糧菜兼用，營養(yǎng)全面，適應性廣，是全球重要的糧食作物[7]。馬鈴薯是世界上最大的非谷物類食品。全球馬鈴薯種植面積大約為1 900萬hm2，年產(chǎn)鮮薯重約3.3億t[8]。近50年來，中國馬鈴薯的種植面積和總產(chǎn)量均迅速增長，至2013年，種植面積達277.5萬hm2，是1961年的4.4倍；總產(chǎn)量達8 898.7萬t，是1961年的6.9倍。1961—2013年，中國馬鈴薯的種植面積和總產(chǎn)量占世界的比重均顯著增加5倍多，至 2013年，分別達到29.7%和24.2%[9]。目前中國已是世界第一大馬鈴薯生產(chǎn)國[8]。在2010年的兩會上，提出了“確立馬鈴薯主糧地位、促進糧食增產(chǎn)、確保糧食安全”提案，馬鈴薯主糧化概念被正式提出，2015年農(nóng)業(yè)部把馬鈴薯主糧化工作列入重要議程[10-11]。馬鈴薯主糧化不僅有助于推進種植業(yè)結構調(diào)整，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，保障我國糧食安全，而且有助于改善和豐富我國居民膳食營養(yǎng)結構。馬鈴薯是無性繁殖作物，其收獲產(chǎn)物——塊莖是其營養(yǎng)器官。馬鈴薯在種植過程中分為整薯種植和切塊種植。我國大部分馬鈴薯種薯產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)的種薯偏大，為節(jié)約用種量、降低成本，傳統(tǒng)的馬鈴薯種植以種薯切塊為主，具有單位面積植株密度較高、雜草較少的優(yōu)點[12]。此外，切塊種植還有較高密度、風險小、能夠更好利用土地中營養(yǎng)物質(zhì)和肥料，灌溉和其它投入小的特點，能夠得到較高比例的中等薯塊和較少的大薯塊、降低生產(chǎn)成本[13-14]。但是帶菌種薯是馬鈴薯病毒病、晚疫病、青枯病、環(huán)腐病等病害發(fā)生的初侵染源，而切塊是傳播的主要途徑，薯切塊質(zhì)量直接影響馬鈴薯出苗率和壯苗[12,15]。在切塊過程中，如果切塊種薯沒有經(jīng)過消毒處理，傷口不能很快愈合、切面易感染細菌而腐爛，極易引起大量爛種，造成馬鈴薯品質(zhì)和產(chǎn)量的下降。此外，切塊種植后多數(shù)側芽薯塊不易出苗，造成田塊缺苗較多，使產(chǎn)量受到一定影響[16]。據(jù)初步田間測定，一般切1刀病薯可傳播20個以上的健薯，最多可達60個[17]。本試驗以EM菌制劑對馬鈴薯種薯進行處理，采用解剖學及生理檢測方法確定該制劑對馬鈴薯薯塊的影響，從而研究EM菌制劑對馬鈴薯種薯的保護作用及生長發(fā)育的影響，以期獲得一種能夠有效提高馬鈴薯種薯保護作用的生物制劑，為進一步發(fā)展馬鈴薯種植產(chǎn)業(yè)，促進農(nóng)民收入提供技術保障。

1　材料與方法

1.1　試驗材料及試驗設計

EM菌制劑：采用日本進口的EM菌制劑為試驗用生物菌。馬鈴薯品種為：克新13號原種，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院提供。

表1EM菌制劑處理

處理處理方法稀釋倍數(shù)(倍)ck無任何處理—處理1EM菌原液加活性炭100處理2EM菌原液加活性炭300處理3EM菌原液加活性炭500處理4EM菌離心液加活性炭100處理5EM菌離心液加活性炭300處理6EM菌離心液加活性炭500處理7EM菌滅菌液加活性炭100處理8EM菌滅菌液加活性炭300處理9EM菌滅菌液加活性炭500

表2不同處理方法薯塊細胞的破壞程度比較

處理方法侵染時間(d)0124ck細胞壁較薄且較完整細胞壁較薄且多數(shù)破裂細胞壁較薄且多數(shù)破裂細胞壁較厚且破裂處理2細胞壁較薄且較完整細胞壁較薄且少數(shù)破裂細胞壁較薄且多數(shù)破裂細胞壁較厚且破裂處理5細胞壁較薄且完整細胞壁較薄且完整細胞壁較薄且較完整細胞壁較薄且少數(shù)破裂處理8細胞壁較薄且較完整細胞壁較薄且少數(shù)破裂細胞壁較薄且多數(shù)破裂細胞壁較厚且破裂

將每個種薯分成2塊，然后在切面上涂抹不同處理(見表1)的EM菌制劑及活性炭，采用9個處理，1個對照，每個處理15個種薯，設2個重復，晾曬后進行室內(nèi)盆栽試驗。

1.2　試驗方法

1.2.1馬鈴薯薯塊生根及發(fā)芽情況調(diào)查

室內(nèi)進行馬鈴薯薯塊生根及發(fā)芽情況的調(diào)查，選擇普通大田土壤，無任何處理，在種植5，10 d時，每個處理隨機挖出3個馬鈴薯薯塊，調(diào)查馬鈴薯薯塊的發(fā)芽數(shù)、不定根的數(shù)量。

1.2.2馬鈴薯薯塊塊莖組織學觀察

根據(jù)馬鈴薯薯塊發(fā)芽生根試驗結果，對其中的處理1、處理5、處理8的種薯進行解剖學觀察。種薯處理方法與1.2.1的方法相同，每組處理取3個大小均勻的馬鈴薯，分別在0 d(播種前)和播種后1，2，4 d時取樣，先用自來水輕輕沖掉馬鈴薯塊莖上基質(zhì)，再用去離子水漂洗3次，用濾紙吸干塊莖上的水分，去掉腐爛部分，切取切面內(nèi)部組織，用FAA固定，進行石蠟切片處理后采用番紅-固綠雙染法對材料進行染色。用光學顯微鏡進行觀察，并在視野中選擇較為典型的結構，進行照相和記錄保存。

1.2.3馬鈴薯種薯抗逆生理指標的測定

根據(jù)發(fā)芽生根試驗結果，對其中的處理1、處理2、處理4、處理5、處理7、處理8的種薯進行生理指標的測定。種薯處理方法與1.2.1的方法相同，分別在種植前12 h、1 d、2 d、4 d、7 d時取樣，先用自來水輕輕沖掉馬鈴薯薯塊上基質(zhì)，再用去離子水漂洗3次，用濾紙吸干塊莖上的水分，去掉腐爛的部分，切取靠近外表面(切面)的內(nèi)部組織，稱重后立即放入液氮中冷卻速凍后，置于-80 ℃冰箱保存。

本試驗采用酶-蛋白聯(lián)合測定法[18-20]測定SOD和POD活性，采用還原膠體幾丁質(zhì)法測定幾丁質(zhì)酶活性、DNS法測定β-1,3-葡聚糖酶活性。

1.3　數(shù)據(jù)分析方法

所有試驗數(shù)據(jù)均采用辦公軟件Excel 2007進行處理，采用SPSS軟件(LED法)和Excel 2007(TTEST檢驗)進行差異顯著性檢驗。

2　結果與分析

2.1　EM菌制劑處理馬鈴薯薯塊試驗生根發(fā)芽情況調(diào)查

用不同EM菌制劑處理馬鈴薯薯塊，對發(fā)芽、不定根的情況進行調(diào)查。采用9種處理，調(diào)查結果如圖1所示，處理1、處理2、處理9發(fā)芽數(shù)隨著種植時間的增加幅度小，趨勢平緩與對照組相比沒有差別，其他處理發(fā)芽數(shù)明顯高于對照組，處理4、處理7發(fā)芽數(shù)增幅度高，EM菌稀釋300倍與稀釋500倍效果差別不大。由圖2可看出，處理7、處理8、處理9不定根效果最好，不定根的數(shù)量極高，經(jīng)過EM菌制劑滅菌處理種薯與EM菌離心液處理種薯，馬鈴薯發(fā)芽情況差別不大，但高于EM菌原液處理。說明EM菌處理對馬鈴薯種薯的生長有促進作用。綜合幾組處理的效果，篩選出較適宜的濃度，各種處理稀釋100倍和稀釋300倍。

圖2　不同處理馬鈴薯薯塊試驗不定根情況

注：1為正常薯塊；2～3為ck，其中2為種植1 d，3為種植2 d；4～5表示處理2的薯塊，其中4為種植1 d，5為種植2 d；6～7為處理5的的薯塊，6為種植1 d，7為種植2 d；8～9為處理8的薯塊，8為種植1 d，9為種植2 d。S表示淀粉粒； W表示細胞壁。圖3　馬鈴薯種薯的細胞結構變化觀察

2.2　馬鈴薯種薯的組織學觀察

通過對發(fā)芽及不定根的試驗篩選出適宜的稀釋濃度，在這個濃度下，對不同EM菌制劑處理馬鈴薯種薯的解剖結構進行觀察，結果如表2所示。結果表明，在相同的稀釋倍數(shù)，采用3種不同的處理方法，種薯在種植過程中，其細胞結構的變化存在明顯的差異，對照組在種植1 d時，細胞壁多數(shù)破裂(圖3-1，3-2)，除處理組5細胞壁依舊很完整(圖3-4)外，其他處理組細胞壁較厚且少數(shù)破裂(圖3-6，8)。隨著種植時間的延長，在種植2 d時，除處理組2的細胞壁有少數(shù)破裂、處理5中細胞壁完整外，其他處理組細胞壁多數(shù)破裂(圖3-3，5，7，9)。3種處理在種植初期都表現(xiàn)出對細胞結構完整性的保護，保護程度由高到低的順序為EM菌制劑離心液、EM菌制劑原液及EM菌制劑滅菌，表明由不同EM菌制劑對馬鈴薯塊莖的切口形成了保護，抵抗外界不良環(huán)境對馬鈴薯塊莖的侵害，降低了土壤中微生物的侵入，從而保護了薯塊的完整性。

2.3　馬鈴薯種薯中抗逆生理指標變化

2.3.1馬鈴薯塊種薯中超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化

根據(jù)發(fā)芽及不定根的試驗結果，采用其中6種處理，2個對照，測定塊莖中SOD活性，其塊莖中酶的變化如圖4所示。結果表明，在6組處理中，SOD活性區(qū)別不大，在種植0 d(種植前)時測定SOD活性，經(jīng)過處理的馬鈴薯種薯活性均高于對照組，至12 h后SOD活性呈下降趨勢，1 d后處理組高于對照組，呈上升趨勢，在第4天時馬鈴薯塊莖中SOD活性達到最大值，4 d后SOD活性呈下降趨勢。處理5的SOD活性在第4天活性最強。稀釋300倍的處理比稀釋100倍的處理SOD的活性大。在4 d以后各組馬鈴薯塊莖中的SOD活性開始下降到最低。結果表明，馬鈴薯種經(jīng)EM菌制劑處理后，EM菌制劑中有益菌抵抗土壤中不良環(huán)境的作用，馬鈴薯塊種薯的SOD活性快速上升而高于對照。

圖4　不同處理馬鈴薯種薯中SOD活性的變化

2.3.2馬鈴薯種薯中過氧化氫酶(POD)活性的變化

POD是清除植物體內(nèi)自由基的一種主要保護酶[14]。用EM菌制劑處理馬鈴薯種薯，馬鈴薯種薯中POD活性的變化如圖5所示。由圖5可以看出，6組處理中，馬鈴薯塊莖中的POD活性在種植開始0 d至12 h時呈下降趨勢，1 d后塊莖中POD活性開始增加，到第4天達最高活性，4 d以后活性開始下降。經(jīng)EM菌制劑處理的馬鈴薯種薯中POD的活性高于對照組，處理5的POD活性值在第4天最高，其次是處理7的活性，但處理1、處理2與對照組區(qū)別不大。由此可見，經(jīng)EM菌制劑處理后馬鈴薯塊莖抗病性增強。

圖5　不同處理馬鈴薯塊種薯POD活性的變化

2.3.3馬鈴薯塊種薯細胞壁水解酶活性的變化

對不同EM菌制劑處理馬鈴薯種薯塊莖中幾丁質(zhì)酶活性和β-1，3-葡聚糖酶活性進行測定，結果如圖6所示。從開始種植0 h，對照組幾丁質(zhì)酶的活性低于經(jīng)EM菌制劑處理組，其活性沒有明顯的變化，幾丁質(zhì)酶是細胞壁水解酶的一種，可以分解真菌的細胞壁，阻止其生長繁殖，保護植株，是防御酶的一種，但種薯中，幾丁質(zhì)酶的含量低，其活性很弱，沒有明顯的差別，波動平緩。經(jīng)EM菌制劑處理幾丁質(zhì)酶的活性有一定幅度的增加，在4 d時，幾丁質(zhì)酶活性最強，4 d后活性開始降低。

圖6　不同處理馬鈴薯種薯中幾丁質(zhì)酶的變化

經(jīng)不同EM菌制劑處理的馬鈴薯種薯中β-1，3葡聚糖酶的活性如圖7所示，從種植前0 d至12 h，由于環(huán)境的影響，酶的活性呈下降趨勢，而對照組中酶活性變化小，活性下降后波動較小，沒有明顯的增幅度，且低于處理組，處理5在第4天時酶活性達到最大，4 d后，酶活性開始下降。經(jīng)EM菌制劑處理后，馬鈴薯種薯中細胞壁水解酶的活性增強，加強了馬鈴薯種薯抵抗真菌病害的能力。

圖7　不同處理馬鈴薯種薯中β-1，3葡聚糖酶的變化

3　討　論

段玉云等研究表明，對切塊種薯噴施EM菌制劑后，在切塊表面、芽眼、根毛著生處等周圍會形成一層高濃度的EM保護層，EM菌制劑中的有益微生物類群在這些部位進行繁殖形成優(yōu)勢菌群，在馬鈴薯前期生長過程中這些優(yōu)勢菌群能夠抑制種薯內(nèi)、土壤中有害菌的生長繁殖。其中乳酸菌與放線菌生長過程中分別可產(chǎn)生乳酸和抗菌物質(zhì)，具有極強的殺菌能力，更能有效防止有害微生物從薯塊切面和幼芽、幼根處侵入，從早期就降低種薯感染花葉病、環(huán)腐病等的概率[21]。杜巍等采用大區(qū)對比法在馬鈴薯苗期葉面用艾米樂(一種新型復合微生物制劑，即EM菌肥)噴施和灌根，發(fā)現(xiàn)無論是噴施還是灌根增產(chǎn)和淀粉含量提高效果都極顯著，且灌根比噴施效果好[22]。綠色無殘留物的微生物種衣劑是目前研究的重點，本試驗采用9種不同的EM菌制劑處理馬鈴薯種薯，然后進行種植，調(diào)查馬鈴薯種薯生根發(fā)芽情況，篩選適宜的濃度，試驗結果表明，有6種不同的EM菌制劑對馬鈴薯種薯處理效果較好，稀釋濃度為100倍、300倍。選擇其中1種濃度的不同EM菌制劑(稀釋300倍)對馬鈴薯種薯進行處理，調(diào)查對馬鈴薯薯塊的保護作用。結果表明，EM菌制劑保護了馬鈴薯塊莖內(nèi)部細胞結構的完整性，抵抗了真菌的侵染，防止馬鈴薯種薯內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的流失。EM菌制劑離心液上清液稀釋300倍的保護程度最高，EM菌原液稀釋液其次，最后為EM菌制劑滅菌液。

經(jīng)過處理的馬鈴薯薯塊中抗逆生理指標SOD、POD的測定結果顯示，馬鈴薯種薯經(jīng)EM菌制劑處理后2種酶的活性明顯升高且高于對照組，說明EM菌制劑對馬鈴薯有一定的保護作用。SOD、POD屬于抗氧化酶，能夠分解馬鈴薯種薯中氧化因子，抵抗外界不良環(huán)境對馬鈴薯的影響，防止馬鈴薯快速氧化，減緩植株衰老，延長生命發(fā)育期。幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶都屬于細胞壁水解酶，而幾丁質(zhì)和β-1，3-葡聚糖是有害病原菌細胞壁的主要成分，如真菌。因此幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶能夠分解病原菌的細胞壁，破壞其活性，阻止其繁殖，提高種薯的抗病性。β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶還具有協(xié)同作用，比單種酶抑菌能力更強[23]。當馬鈴薯種薯處在逆境環(huán)境中，種薯中的抗逆酶開始作用，對種薯形成保護。種薯中的抗氧化酶、細胞壁水解酶都會隨著時間、環(huán)境的不同，表現(xiàn)出不同的活性。不同品種的抗逆酶活性不同，本試驗中，供試的馬鈴薯種薯酶活性較低，但經(jīng)EM菌制劑處理后，馬鈴薯塊莖中各種的酶的活性均有提高，高于對照組。EM菌制劑增強了馬鈴薯的抗逆性，有效地預防了病菌的侵染，起到了保護種薯的作用。