酶法合成對(duì)羥基苯甘氨酸工藝研究

賀瑩

摘 要：該文通過(guò)生物酶法合成中對(duì)酶反應(yīng)的各項(xiàng)條件比色法的測(cè)定，結(jié)果表明，在溫度40℃、pH值8.5、底物濃度4%、酶濃度80mg/mL條件下，酶活力最高，金屬離子Co2+、Mn2+ 和Ni2+ 對(duì)酶活力有促進(jìn)作用，從而使酶反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品的收率達(dá)到最大化，進(jìn)而可以運(yùn)用于其工業(yè)化的生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：酶法合成；D-對(duì)羥基苯甘氨酸；茚三酮顯色法；酶活力

中圖分類號(hào) TS213.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）03-04-0016-2

Abstract：Enzymatic is to obtain optical pure D-hydroxy phenyl glycine on important way. Based on the enzymatic synthesis of enzyme reaction in the conditions for the determination of colorimetric method，it is concluded that the enzyme reaction optimum temperature of 40 ℃，the optimum pH value of 8.5，the optimum substrate concentration was 4%，the optimal enzyme concentration was 80 mg/mL and metal ions can improve the enzyme reaction dynamic Co2+，Mn2+and Ni2+，etc. So that the enzyme reaction conversion and product yield to maximize，and can be applied to the industrialized production.

Key words：Enzymatic synthesis.；D - hydroxy phenyl glycine；Ninhydrin color；Enzymatic activity

D-對(duì)羥基苯甘氨酸，分子量為167.16，熔點(diǎn)為204℃，微溶于乙醇和水，易溶于酸或堿溶液生成鹽[1-2]。國(guó)內(nèi)大部分的生產(chǎn)企業(yè)基本也都采用乙醛酸工藝生產(chǎn)[3-4]。而這2種方法都為D-對(duì)羥基苯甘氨酸的化學(xué)生產(chǎn)法，這類方法不僅污染較大，生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生氰化物，毒性高，而且原料昂貴、產(chǎn)量低、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，還會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄物，因而學(xué)者們開(kāi)始研究用酶法生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸[4-6]。

生物酶法生產(chǎn)又可分為2種，分別為酶拆分法和酶轉(zhuǎn)化法，本實(shí)驗(yàn)主要研究酶轉(zhuǎn)化法。酶轉(zhuǎn)化法是指以DL-對(duì)羥基苯海因?yàn)榈孜?，利用海因酶先將底物水解為N-氨甲?；?D-對(duì)羥基苯甘氨酸，然后再用D-N-氨甲酰基氨基酸水解酶脫去氨甲?；玫紻-對(duì)羥基苯甘氨酸[7]的過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 試劑 D-海因酶，N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶為上海源葉生物科技有限公司，DL-對(duì)羥基苯海因，氫氧化鈉，鹽酸，水合茚三酮，正丁醇為天津市天力化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備 高壓滅菌鍋：江陰濱江，pH計(jì)：上海雷磁，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北分瑞利。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8-9]。

1.3.2 底物濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響 制備好4種不同濃度梯度的DL-對(duì)羥基苯海因溶液，分別為2%、4%、6%和8%，然后滴加NaOH溶液與HCl溶液，濃度都為6mol/L，使初始pH值調(diào)為9；在制備好的底物溶液中加入與底物相同質(zhì)量的酶溶液，再在錐形瓶中通入氮?dú)庖灾脫Q出氧氣，并用保鮮膜進(jìn)行密封；然后在水浴恒溫振蕩器中振蕩反應(yīng)48h，溫度為33℃，得到反應(yīng)液，待測(cè)[10]。

1.3.3 pH對(duì)酶反應(yīng)的影響 稱取0.38g的DL-對(duì)羥基苯海因粉末，溶解于90mL1/15M的磷酸鹽緩沖液中（取5種不同的pH值，分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0），并加熱進(jìn)行溶解；溶解后取9mL溶液裝于錐形瓶中，同時(shí)加入相同濃度的1.0mL酶溶液，再在錐形瓶中通入氮?dú)庖灾脫Q出氧氣，并用保鮮膜進(jìn)行密封；然后在水浴恒溫振蕩器中振蕩反應(yīng)30min，溫度為33℃，后再加入濃度為6mol/L的HCl終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液，待測(cè)。

1.3.4 溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響 按照測(cè)酶活力的方法，在4種不同溫度條件下測(cè)定其酶活力，分別為30℃、33℃、35℃和40℃，在水浴恒溫振蕩器中振蕩反應(yīng)30min；后再加入濃度為6mol/L 的HCl溶液終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液，待測(cè)。

1.3.5 酶濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響 配制3種濃度分別為40mg/mL、60mg/mL和80mg/mL的酶溶液備用；然后制備底物濃度為4mg/mL的DL-對(duì)羥基苯海因溶液，并滴加NaOH溶液與HCl溶液，濃度都為6mol/L，使初始pH 值調(diào)為9；再取3個(gè)錐形瓶，每個(gè)錐形瓶中分別裝入10mL溶液，同時(shí)在其中加入相同體積已配好的酶溶液，并在錐形瓶中通入氮?dú)庖灾脫Q出氧氣，用保鮮膜進(jìn)行密封；最后在水浴恒溫振蕩器中振蕩反應(yīng)，按24h，36h，48h等不同時(shí)間段，溫度為33℃，并得到反應(yīng)液，待測(cè)。

1.3.6 金屬離子對(duì)酶反應(yīng)的影響 制備濃度為4mg/mL的DL-對(duì)羥基苯海因溶液，并滴加NaOH溶液與HCl溶液，濃度都為6mol/L，使初始pH值調(diào)為9；再取5個(gè)錐形瓶，每個(gè)錐形瓶中分別裝入10mL溶液，同時(shí)在其中加入相同質(zhì)量的酶溶液，再在其中分別滴加含Co2+、Mn2+、Ni2+、Hg2+和Cu2+的溶液，并在錐形瓶中通入氮?dú)庖灾脫Q出氧氣，用保鮮膜進(jìn)行密封；最后在水浴恒溫振蕩器中振蕩反應(yīng)48h，溫度為33℃，得到反應(yīng)液，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物濃度對(duì)產(chǎn)物濃度的影響 從表1分析可得，酶濃度越大，生成相似濃度的產(chǎn)物所用時(shí)間越少，即加大酶濃度，酶反應(yīng)速率加快。

2.2 pH值對(duì)酶活力的影響 從表2中分析可得，當(dāng)pH值為8.5時(shí)，酶反應(yīng)的活力最高。

2.3 溫度對(duì)酶活力的影響 從表3中分析可得，當(dāng)溫度為40℃時(shí)，酶反應(yīng)的活力最高。

2.4 金屬離子對(duì)酶活力的影響 從表4可知，當(dāng)pH值和溫度都適宜時(shí)，酶反應(yīng)的活力大約0.320～0.340，所以通過(guò)比較可得知，Co2+、Mn2+和Ni2+對(duì)酶反應(yīng)的活力有加強(qiáng)作用，而Hg2+和Cu2+對(duì)酶反應(yīng)的活力有抑制作用。

3 結(jié)論

采用茚三酮顯色法對(duì)不同酶反應(yīng)條件下生成的D-對(duì)羥基苯甘氨酸進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)酶活力公式的計(jì)算，得出了該酶反應(yīng)的最適底物濃度為4%、最適pH值為8.5、最適溫度為40℃以及可以起酶活力加強(qiáng)作用的金屬離子為Co2+、Mn2+和Ni2+。

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（責(zé)編：張宏民）