基于ImageJ軟件的香樟千粒重的測(cè)量及其應(yīng)用

鐘永達(dá) 周燕玲 李彥強(qiáng) 劉立盤(pán) 劉淑娟 楊?lèi)?ài)紅 劉騰云 余發(fā)新

摘 要：研究香樟種子千粒重的變異水平，不僅有助于香樟的遺傳改良，而且有助于香樟產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?，F(xiàn)有基于人工計(jì)數(shù)的香樟種子千粒重測(cè)量方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且容易出現(xiàn)誤差，尤其不適合大樣本的處理。該研究利用掃描儀獲取標(biāo)準(zhǔn)圖形，通過(guò)ImageJ軟件自動(dòng)計(jì)數(shù)，稱(chēng)重后得到千粒重，并與人工計(jì)數(shù)法進(jìn)行了比較；利用該方法對(duì)江西境內(nèi)具有地理代表性和古樟分布廣泛的10個(gè)種源種子的千粒重進(jìn)行了測(cè)定，分析了其種源及家系間的變異水平。結(jié)果表明：圖像測(cè)定法能快速、準(zhǔn)確對(duì)香樟種子進(jìn)行計(jì)數(shù)，大大提高了千粒重測(cè)定的速度；江西局部種源香樟種子千粒重之間的變異主要來(lái)自于種源間，群體平均多樣性指數(shù)為1.10，遺傳多樣性水平較低，且千粒重性狀受地理氣候因子影響較小。

關(guān)鍵詞：香樟；千粒重；ImageJ軟件；種源；變異

中圖分類(lèi)號(hào) S792 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）10-0082-04

Application of ImageJ Analysis Software in Measuring 1000-Seed Weight of Cinnamomum

camphora

Zhong Yongda et al.

（The Key Laboratory of Horticultural Plant Genetic and Improvement of Jiangxi，Institute of Biological Resources，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330096，China）

Abstract：The variation research on camphor 1000-seed weight will both contribute to the improvement of genetic breeding and promote the development of camphor industry.However，the measurement of camphor 1000-seed weight based on artificial counting are time-consuming，laborious and prone to error，especially not suitable for large sample processing.In our research，we use the scanner to obtain the standard graphics，counting automatically by ImageJ software，calculating 1000-seed wright after weighing，and compared it with the artificial counting method.Then the camphor 1000-seed weight from Jiangxi provenance and its variation were analyzed.The results showed that scanner with ImageJ software provides a rapid and accurate way to the camphor seeds counting.1000-seed weight variations among camphor trees from Jiangxi mainly come from the provenance，the average diversity index is 1.10 which suggested small genetic variation level among populations，and less affected by climatic factors.

Key words：Cinnamomum camphora；1000-seed weight；ImageJ analysis software；Provenance；Variation

植物種子形態(tài)是植物生活史循環(huán)中的核心特征之一[1]，深刻影響著植物的種子壽命、種子發(fā)芽率、實(shí)生苗建成、物種更新能力和種群分布格局等各個(gè)方面[2-6]。種子千粒重是林木分類(lèi)學(xué)上的一種重要性狀，在林木遺傳研究上具有重要價(jià)值[7]，更是育苗中確定播種量的直接依據(jù)之一。傳統(tǒng)的千粒重測(cè)定方法是人工計(jì)數(shù)后天平稱(chēng)重，經(jīng)過(guò)換算獲得千粒重，但人工計(jì)數(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不但效率低而且誤差較大。種子自動(dòng)數(shù)粒儀的出現(xiàn)一定程度上解決了千粒重的自動(dòng)測(cè)定問(wèn)題[7-9]，但由于種子在穿過(guò)檢測(cè)區(qū)時(shí)會(huì)有疊影現(xiàn)象，易造成計(jì)數(shù)失誤[9]，而且對(duì)于大樣本量而言，即使利用數(shù)粒機(jī)仍很費(fèi)時(shí)。因此，如何快速準(zhǔn)確進(jìn)行種子計(jì)數(shù)成為千粒重性狀研究的關(guān)鍵。

香樟[Cinnamomum camphora （L.）Presl]是我國(guó)珍貴材用和經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，與楠、梓、桐合稱(chēng)為江南四大名木，為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[10]。主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江以南的江西、浙江、福建、臺(tái)灣等東南沿海省份，朝鮮、越南、日本等地亦有分布，其他各國(guó)有引種栽培[11]。江西全省各地遍布古香樟，現(xiàn)在保存的古樟林有300余處，被譽(yù)為“樟樹(shù)之鄉(xiāng)”的安?？h400年以上的香樟有8700多株，1000年以上的有200多株[12]。中國(guó)開(kāi)發(fā)利用香樟的歷史悠久，在距今約7000年的河姆渡遺址中就發(fā)現(xiàn)有樟木的使用。香樟種子不僅是香精香料的重要原料，而且還可以制備輕質(zhì)生物柴油、表面活性劑以及高級(jí)洗衣皂、香皂等，果皮還可入藥[3]。因此，開(kāi)展香樟種子千粒重表型變異的研究，不僅有助于香樟的遺傳改良研究，也有助于其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的開(kāi)發(fā)。任華東等通過(guò)分析我國(guó)香樟47個(gè)種源的種子百粒重認(rèn)為，種子百粒重在產(chǎn)地間存在顯著差異。東南部的江西、福建及浙江南部種源的種子普遍較大，江西井岡山、上饒和遂川三地的香樟種子平均百粒重為18.55g，而云南及廣東種源的種子相對(duì)較小。但此次研究中每個(gè)種源為10～12棵母樹(shù)混合采種，未進(jìn)行家系研究[13]。李芳等對(duì)7個(gè)省41個(gè)種源的香樟種子的千粒重進(jìn)行了研究，結(jié)果表明樟樹(shù)種子千粒重在種源間差異顯著，與經(jīng)度存極顯著正相關(guān)[14]。本實(shí)驗(yàn)室以材用香樟為目標(biāo)，收集了12個(gè)種源，每種源隨機(jī)選取3個(gè)家系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)千粒重在種源和家系間的遺傳變異達(dá)到極顯著水平[15]。上述香樟種子千粒重的測(cè)量大都基于傳統(tǒng)方法進(jìn)行，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，尤其不適用于大樣本大數(shù)據(jù)量的處理。近年來(lái)，隨著數(shù)碼照相技術(shù)以及計(jì)算機(jī)圖像處理軟件發(fā)展，為快速簡(jiǎn)便進(jìn)行香樟種子計(jì)數(shù)提供了可能。例如美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，USA）開(kāi)發(fā)的用于科研和臨床中的醫(yī)學(xué)影像分析的ImageJ軟件[16]，通過(guò)圖像處理和分析，可以輕松實(shí)現(xiàn)血細(xì)胞和腦皮層細(xì)胞的計(jì)數(shù)，與人工計(jì)數(shù)相比，效率提高10倍以上[17，18]。本研究利用掃描儀結(jié)合ImageJ軟件對(duì)香樟種子進(jìn)行計(jì)數(shù)，天平稱(chēng)重，計(jì)算得到香樟種子千粒重，所有分析均可以在個(gè)人電腦上完成。在此基礎(chǔ)上，選取江西境內(nèi)具有地理代表性和古樟分布廣泛的10個(gè)種源，100株香樟為材料，對(duì)其種子千粒重大小變異進(jìn)行了研究，為香樟等林木種子千粒重的大樣本量測(cè)定提供高效技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 2014年11月底，分別選取江西省科學(xué)院院內(nèi)、江西寧都和安徽安慶3個(gè)種源各1棵成年期香樟，采摘紫黑色種子帶回實(shí)驗(yàn)室，清水浸泡2～3d使果皮吸水軟化，用細(xì)沙搓揉除凈果皮果肉，洗凈陰干后利用2種方法分別測(cè)定千粒重。另外選取江西境內(nèi)具有地理代表性和古樟分布廣泛的10個(gè)種源地，每種源10個(gè)家系測(cè)量千粒重（表1）。

1.2 圖像測(cè)定法

1.2.1 掃描拍照 選取待測(cè)香樟種子150～200粒，平鋪于白布上，種子之間隔開(kāi)一定距離。在白布邊上擺一把有刻度的直尺，作為“標(biāo)尺”用于在該掃描模式下像素值與距離值的轉(zhuǎn)換。采用紫光高清拍攝儀Unispro G760（或其他掃描儀）進(jìn)行掃描，保存文件。

1.2.2 圖像處理 運(yùn)行ImageJ軟件，Open導(dǎo)入照片。選取直尺上已知距離，打開(kāi)Analyze/Set Scale，設(shè)定參數(shù)。Distance in Pixels為掃描時(shí)的分辨率；Known Distance為選取的直尺距離；Pixel Aspect Ratio可理解為放大倍數(shù)，由于掃描時(shí)多為100%掃描，此處設(shè)置為1.0；Unit of Length為已知距離的長(zhǎng)度單位，點(diǎn)擊OK進(jìn)入下一步驟。打開(kāi)Image/type/8-bit和Image/Adjust/Threshold，將待測(cè)種子彩色圖像轉(zhuǎn)換成黑白二值圖像，種子自動(dòng)用黑色進(jìn)行填充。最后，打開(kāi)Analyze文件下的Analyze Particles進(jìn)行計(jì)數(shù)，設(shè)置Size（mm2）（10-100）和Circularity（0.50～1.00）去除假陽(yáng)性。點(diǎn)擊OK，輸出結(jié)果。該結(jié)果可以保存也可直接復(fù)制粘貼至Excel表中進(jìn)行處理。

1.2.3 千粒重?fù)Q算 用精度為0.001g天平稱(chēng)重，根據(jù)ImageJ軟件測(cè)定的粒數(shù)，換算成千粒重。

1.3 人工計(jì)數(shù)測(cè)定法 測(cè)定方法按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2772-1999進(jìn)行。從待測(cè)定的香樟種子中隨機(jī)選取8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒，分別稱(chēng)重。計(jì)算變異系數(shù)，如果變異系數(shù)不超過(guò)4，則將各重復(fù)換算成千粒重并取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析 對(duì)上述測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用Excel2010進(jìn)行調(diào)查數(shù)據(jù)錄入和整理，并計(jì)算各性狀的平均值（X）、標(biāo)準(zhǔn)差（σ）、變異系數(shù)（CV）等；根據(jù)平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差的結(jié)果將每個(gè)性狀分為6級(jí)，1級(jí)，

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟種子千粒重測(cè)定方法的比較 用人工計(jì)數(shù)法和圖像測(cè)定法分別測(cè)量香樟種子的千粒重（表2），結(jié)果顯示，2種方法在測(cè)定香樟種子千粒重時(shí)差異不顯著，而且圖像測(cè)定法變異系數(shù)更小，說(shuō)明圖像測(cè)定法是可行的，且更穩(wěn)定。

2.2 江西10個(gè)種源香樟種子千粒重表型變異 利用圖像測(cè)定法對(duì)江西10個(gè)種源、100株香樟種子的千粒重進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明（表3），婺源種源千粒重平均值最小，僅為110.83g；吉安種源最大，為152.68g。千粒重最大的家系來(lái)自湖口，為205.62g；千粒重最小的家系來(lái)自永修，僅為73.95g。變異系數(shù)介于13.29%～25.18%，最大的是湖口種源，最小的是安義種源。10個(gè)群體的遺傳多樣性指數(shù)介于0.80～1.50，其中最高的為湖口群體，最低的是全南群體，平均遺傳多樣性指數(shù)為1.10，表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性水平。

雙因素方差分析結(jié)果表明（表4），千粒重性狀在各種源間的差異達(dá)到極顯著水平，家系間差異不顯著，說(shuō)明香樟種子千粒重的差異主要存在于種源間。

2.3 聚類(lèi)分析 對(duì)香樟各種源的種子大小進(jìn)行聚類(lèi)分析，其結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，10個(gè)種源可以分為2大類(lèi)群，安福、瑞昌、全南、靖安、永修和婺源聚為一大類(lèi)；吉安、湖口、遂川和安義聚為一類(lèi)。聚類(lèi)結(jié)果與地理種源沒(méi)有直接關(guān)系，說(shuō)明香樟種子千粒重與經(jīng)緯度沒(méi)有直接相關(guān)性且可能是由微效多基因控制。

2.4 江西10個(gè)種源香樟種子千粒重對(duì)地理氣候因子的響應(yīng) 通過(guò)相關(guān)性分析結(jié)果表明（表5），香樟種子千粒重與經(jīng)度、緯度、海拔呈負(fù)相關(guān)，與年均氣溫正相關(guān)，但都未達(dá)到顯著水平，說(shuō)明江西省內(nèi)種源香樟種子千粒重對(duì)地理氣候因子的響應(yīng)較小。

3 結(jié)論與討論

樹(shù)木種子大小影響著樹(shù)木的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)等一系列特征[1]。目前，學(xué)者們對(duì)林木種子的千粒重變異情況進(jìn)行了廣泛研究，但大多采用人工計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行測(cè)定[13-15，20-23]。ImageJ軟件已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)細(xì)胞的自動(dòng)計(jì)數(shù)中，并展現(xiàn)出相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性和簡(jiǎn)便性[24]。本研究利用掃描儀或其他拍照工具獲得標(biāo)準(zhǔn)圖像，利用ImageJ軟件的分析功能可以實(shí)現(xiàn)種子粒數(shù)的自動(dòng)測(cè)定。與人工計(jì)數(shù)測(cè)定法相比，本方法在保證準(zhǔn)確性的前提下（表2），大大縮短了計(jì)數(shù)時(shí)間，并減少了人工計(jì)數(shù)可能帶來(lái)的誤差。根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，用圖像處理法測(cè)量100份每份100～200粒香樟種子千粒重，1個(gè)人6h內(nèi)可以完成，如果用人工計(jì)數(shù)，大概需要18h，效率提高3倍以上。不僅如此，通過(guò)ImageJ軟件分析，還可以對(duì)種子大小性狀進(jìn)行測(cè)量，進(jìn)行種子大小的全面分析。所有得到的數(shù)據(jù)均將自動(dòng)保存在Excel表中，減少了數(shù)據(jù)錄入時(shí)間。

長(zhǎng)期的地理隔離造成的基因漂移，可能導(dǎo)致同一個(gè)樹(shù)種的不同地理種源在種內(nèi)出現(xiàn)變異[14]。香樟是一個(gè)古老的樹(shù)種，早在石炭紀(jì)已有香樟植物的化石。在長(zhǎng)期的自然演替和進(jìn)化過(guò)程中，形成了江西不同的地理種源間種子千粒重的差異。本研究利用圖像測(cè)定法，對(duì)江西省境內(nèi)具有地理代表性且古香樟分布廣泛的10個(gè)種源、100個(gè)家系的種子千粒重進(jìn)行了測(cè)定和表型變異分析。結(jié)果表明，江西10個(gè)種源香樟種子千粒重之間的變異主要來(lái)自于種源間，家系間差異不顯著（表4）。本實(shí)驗(yàn)室前期利用材用香樟群體為材料也得到了相似的結(jié)論[15]，與李芳[14]、任華東[13]等人的研究結(jié)果相似，說(shuō)明在相似的地理氣候條件下，遺傳是決定種子重量的決定因素。然而，本研究中種源內(nèi)家系間的差異未達(dá)到顯著水平，且群體內(nèi)的遺傳多樣性水平較低（表3，表4），暗示了江西省內(nèi)各個(gè)種源在長(zhǎng)期的地理隔離過(guò)程中，形成了遺傳的有效隔離。相關(guān)研究表明，種子千粒重的地理梯度變異是一個(gè)受生境水分、溫度、海拔等多因素控制的復(fù)雜過(guò)程，是植物對(duì)不同生境下“脅迫耐受假說(shuō)”和“資源限制假說(shuō)”的權(quán)衡選擇的結(jié)果[25]。李芳和任華東等研究均認(rèn)為，香樟種子的千粒重與經(jīng)度呈顯著正相關(guān)，隨著經(jīng)度的增加，種子越重，即東部種源種子千粒重往往較大[13，14]。而其他一些研究結(jié)果認(rèn)為，植物種子的重量與緯度呈顯著負(fù)相關(guān)，即緯度越高，種子越輕[26]。然而，本研究中相關(guān)性分析表明，江西省內(nèi)種源種子千粒重與經(jīng)緯度、海拔、年均氣溫等相關(guān)性均不顯著（表5），聚類(lèi)分析結(jié)果也表明種子千粒重與經(jīng)緯度沒(méi)有直接相關(guān)性（圖1），這可能是本研究?jī)H針對(duì)江西省內(nèi)局部種源，經(jīng)度大都在東經(jīng)114°～116°，取樣范圍比較集中所致。香樟種子千粒重的地理梯度變異情況仍需進(jìn)一步深入研究。

本研究通過(guò)掃描儀獲取標(biāo)準(zhǔn)圖像，利用ImageJ軟件自動(dòng)輸出種子粒數(shù)，無(wú)需編程就可實(shí)現(xiàn)大量樣品的處理。將圖像測(cè)定法應(yīng)用于江西省內(nèi)種源大樣本量香樟種子千粒重的變異研究，驗(yàn)證了該方法的有效性。相比傳統(tǒng)的人工計(jì)數(shù)法，該方法快速簡(jiǎn)便，且穩(wěn)定有效，有利于大樣本量香樟種子千粒重的研究。

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（責(zé)編：張宏民）