靈芝—銀杏雙向固體發(fā)酵抗氧化性優(yōu)化及活性物質(zhì)的研究

辛燕花 楊丹 劉陽 白曉靜 張鐵丹

摘 要：以靈芝菌株作為出發(fā)菌株，以銀杏葉作為基質(zhì)，通過雙向發(fā)酵工程技術(shù)，對(duì)靈芝菌株的抗氧化性及活性物質(zhì)進(jìn)行了研究。通過測(cè)定超氧自由基清除能力、還原能力、羥基自由基清除能力對(duì)新型菌株的抗氧化性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了靈芝—銀杏雙向固體發(fā)酵的最佳條件結(jié)果表明：在銀杏葉添加量為5g/袋（300g），培養(yǎng)料含水率為70%、滅菌時(shí)間90min的條件下，靈芝菌株的還原力達(dá)到0.374；活性物質(zhì)多糖含量為51.60 mg/g，三萜含量為14.42 mg/g，總黃酮質(zhì)含量為5.76 mg/g，分別是對(duì)照的1.98倍、2.02和2.35倍。

關(guān)鍵詞：靈芝；銀杏；雙向發(fā)酵；抗氧化性；活性物質(zhì)

中圖分類號(hào) TQ61；TQ929 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）10-0014-05

Study on the Antioxidative Optimization and Active Substances of Ganoderma lucidum and Ginkgo biloba Bi-directional Solid Fermentation

Xin Yanhua1 et al.

（1 Department of Biology，Xinzhou Teachers University，Xinzhou 034000，China）

Abstract：Using bi-directional solid fermentation technology，Ginkgo biloba for medicinal matrix and Ganoderma lucidum as fermentation strain，the bi-directional solid fermentation conditions were optimized with the antioxidant activity （reducing power，superoxide radical scavenging and OH- scavenging） as the main index through single factor and orthogonal test，and the active materials were measured.Result showed that the optimum fermentation culture conditions were：the amount of Ginkgo biloba 5g/bag （300g），moisture content in medium was 70%，sterilizing time was 90min.In the condition，the antioxidant activity of fermentation medium was the highest，reducing power was 0.374；and the yield of polysaccharide，triterpene compounds and total flavonoids 51.60mg/g，14.42 mg/g and 5.76 mg/g，compared with the control，these active materials were up to 1.98，2.02，and 2.35 times respectively.

Key words：Ganoderma lucidum；Ginkgo biloba；Bi-directional fermentation；Antioxidant activity；Active material

“藥用真菌雙向發(fā)酵工程”是指以藥用真菌為發(fā)酵菌株，以具有活性成分的各種中藥材作為基質(zhì)，該基質(zhì)既提供真菌生長所需的營養(yǎng)，又因真菌的分解（合成）而產(chǎn)生新的成分，從而使整個(gè)發(fā)酵作用具有雙向性[1]。雙向發(fā)酵的產(chǎn)物，同時(shí)具備藥用真菌和中藥材的成分和功效，還可能產(chǎn)生新的性味和功效，通過不同真菌與不同中藥材交叉、復(fù)合組合可構(gòu)成大量的組合，產(chǎn)生種類繁多的發(fā)酵產(chǎn)物，該發(fā)酵產(chǎn)物可作為創(chuàng)新中藥材的材料[2]。

靈芝（Ganoderma lucidum）是多孔菌科真菌，靈芝的子實(shí)體，俗稱靈芝草，仙草、瑞草[3]，是一種食藥兼用真菌，具有較強(qiáng)的抗氧化能力。現(xiàn)代藥理與臨床研究表明，靈芝具有多種功效，包括保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗組織胺釋放、抗衰老、抑制HIV-1蛋白酶活性、抑制血管緊張素以及調(diào)節(jié)血糖等[4-5]。銀杏（Ginkgo Liloba L.）是銀杏科銀杏屬植物，俗稱白果樹，是目前應(yīng)用最為廣泛的中藥材之一。大量研究證實(shí)銀杏葉中含有黃酮和二萜內(nèi)酯等化學(xué)成分，具有抗氧化、抗衰老等作用[6]。近年來，靈芝雙向發(fā)酵技術(shù)的研究進(jìn)展迅速，魏龍、楊海龍、王林等[7，8]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)靈芝過程中，添加適量的中藥材，如黃芪、玄參、當(dāng)歸、黨參粉末或其水提取物等，可以有效提高靈芝的抗氧化性。本課題組通過在液體培養(yǎng)基中添加銀杏葉粉末發(fā)酵靈芝后，發(fā)現(xiàn)靈芝菌絲體中的抗氧化性及活性物質(zhì)明顯提高[9]。因此，本研究繼續(xù)探索以銀杏葉為培養(yǎng)基質(zhì)在固體發(fā)酵條件下靈芝子實(shí)體的抗氧化性及活性物質(zhì)成分，為藥用真菌和中藥材的雙向固體發(fā)酵提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 靈芝購于福建食用菌研究所；銀杏葉采摘于忻州師范學(xué)院；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海阿拉丁生化試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海阿拉丁生化試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 立式雙層智能精密型搖床（BSD-YX3200）：上海助泰有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-8）：力辰科技有限公司；離心機(jī)（TG-16B）：昊天儀器有限公司；臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)（Scientz-10N）：寧波新芝儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-30KBS）：上海申安有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（721-100）：上海菁華儀器有限公司。

1.2 最適發(fā)酵單因素試驗(yàn)

1.2.1 樣品處理 將新鮮的銀杏葉，放置在真空冷凍干燥機(jī)中，冷阱溫度-40℃、真空度20Pa、加熱板溫度10℃。冷凍干燥8h，質(zhì)量不變，粉碎備用。

1.2.2 銀杏葉影響因子 以基礎(chǔ)培養(yǎng)料（棉籽殼98%，蔗糖1%，石膏1%）裝袋，每袋含量300g，分別加入銀杏葉5、10、15、20、25g，各3組平行實(shí)驗(yàn)，28℃避光培養(yǎng)，待靈芝子實(shí)體成熟時(shí)，測(cè)定子實(shí)體的抗氧化性。

1.2.3 基質(zhì)含水率影響因子 以確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)銀杏葉的量為基礎(chǔ)配料，設(shè)置培養(yǎng)基的含水率為55%、60%、65%、70%、75%五個(gè)梯度，121℃，滅菌2h，28℃避光培養(yǎng)，各3組平行實(shí)驗(yàn)，待靈芝子實(shí)體成熟時(shí)，測(cè)定子實(shí)體的抗氧化性。

1.2.4 基質(zhì)滅菌時(shí)間影響因子 以確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)銀杏葉的量為基礎(chǔ)配料，以最適含水量浸泡過夜，拌勻裝袋在121℃下分別滅菌30、60、90、120min，各3組平行實(shí)驗(yàn)，28℃避光培養(yǎng)，待靈芝子實(shí)體成熟時(shí)，測(cè)定子實(shí)體的抗氧化性。

1.3 最適發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)表L9（33）對(duì)發(fā)酵銀杏量、基質(zhì)含水量、基質(zhì)滅菌時(shí)間進(jìn)行3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)（表1），每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理進(jìn)行3次重復(fù)。正交實(shí)驗(yàn)所得發(fā)酵產(chǎn)物以其還原力為指標(biāo)，進(jìn)行極差和方差分析，確定最佳發(fā)酵條件。

1.4 抗氧化活性的測(cè)定 能力測(cè)定參照文獻(xiàn)進(jìn)行[10]。

1.5 活性物質(zhì)的測(cè)定 多糖的提取參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.3277x-0.0052，R2=0.9991。

總?cè)频奶崛⒖嘉墨I(xiàn)[12]進(jìn)行，以熊果酸標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 5.894x-0.0105，R2=0.9992。

總黃酮的提取參照文獻(xiàn)進(jìn)行[13]，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.7492x+0.0102，R2=0.9997。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS Statistics 21軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素條件確定

2.1.1 接種銀杏葉因素 通過在培養(yǎng)料中添加不同含量的銀杏葉基質(zhì)，考察靈芝子實(shí)體的抗氧化性能力，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，銀杏葉基質(zhì)含量對(duì)靈芝子實(shí)體的抗氧化性有一定的影響，添加銀杏葉的含量為10g/袋時(shí)，發(fā)酵后靈芝菌絲體的抗氧化性最高，為最佳添加質(zhì)量濃度。

2.1.2 培養(yǎng)料含水量因素 通過測(cè)定培養(yǎng)料中不同含水率對(duì)發(fā)酵后靈芝子實(shí)體的抗氧化性能力，發(fā)現(xiàn)含水率對(duì)靈芝子實(shí)體的抗氧化性能力有一定的影響。在靈芝子實(shí)體形成過程發(fā)現(xiàn)，含水率在65%、70%、75%這3個(gè)梯度之間時(shí)，菌絲滿袋形成子實(shí)體的速度要明顯高于含水率為55%和60%。從圖2可以看出，隨著培養(yǎng)料含水率的不斷增加，靈芝菌株的還原力、超氧自由基清除能力和羥自由基清除能力都表現(xiàn)出先升高后下降又升高的現(xiàn)象。在含水率為65%時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)都達(dá)到最大值，選取含水率為65%時(shí)作為發(fā)酵培養(yǎng)的最適含水量。

2.1.3 最適滅菌時(shí)間因素 對(duì)靈芝銀杏雙向固體發(fā)酵的最適滅菌時(shí)間進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。滅菌時(shí)間也是影響靈芝子實(shí)體抗氧化能力的一個(gè)重要因素。滅菌時(shí)間為90min時(shí)，發(fā)酵后靈芝菌絲體的抗氧化性最高，為最佳添滅菌時(shí)間。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 基于單因素所得的最佳條件，采用正交表L9（34）安排正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2。

從表2可以看出，對(duì)靈芝子實(shí)體還原力影響最大的是滅菌時(shí)間，其次含水率，影響最小的是銀杏葉添加量，還原力最大的最優(yōu)組合是A1B1C2。進(jìn)一步通過方差分析驗(yàn)證各因素對(duì)靈芝子實(shí)體還原能力的影響程度，結(jié)果見表3。從表3可以看出，對(duì)靈芝子實(shí)體還原力影響顯著的是含水率和滅菌時(shí)間

由于正交試驗(yàn)中得出的最佳發(fā)酵條件（A3B1C2）和在極差分析結(jié)果中得出的最優(yōu)組合（A1B1C2）不一致，通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。即將含水率60%，銀杏葉添加量5g、滅菌時(shí)間90min的條件下進(jìn)行靈芝發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)所得子實(shí)體進(jìn)行還原力的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)的靈芝子實(shí)體的還原力為0.346，低于在正交組合的最大值。因此，選取正交組合中的A3B1C2為發(fā)酵的最優(yōu)組合，含水率為70%，銀杏葉添加量為5g，滅菌時(shí)間為90min。

2.3 靈芝菌株的活性成分分析 進(jìn)一步探討引起發(fā)酵體系抗氧化活性變化的原因，在最優(yōu)條件下，對(duì)發(fā)酵后靈芝子實(shí)體的部分活性成分多糖，總?cè)坪忘S酮進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

從表4可以看出，與靈芝原種相比，以銀杏葉為基質(zhì)的雙向發(fā)酵后靈芝菌株中的多糖、三萜化合物及黃酮含量明顯增加，多糖的含量為51.60mg/g，三萜化合物的含量為4.42mg/g，黃酮的含量為5.76mg/g；分別是對(duì)照的1.98倍、2.02倍和2.35倍。

3 討論

本研究通過一定的優(yōu)化，以銀杏葉為培養(yǎng)基質(zhì)發(fā)酵后的靈芝子實(shí)體的抗氧化性及部分具有抗氧化性的活性物質(zhì)含量明顯提高。

研究報(bào)道，在靈芝發(fā)酵過程中，培養(yǎng)料的組成對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物成分的變化有顯著的影響[14]。在本研究中，以銀杏葉的添加量作為首要的考察因素。結(jié)果表明，高濃度的銀杏葉添加量會(huì)抑制靈芝菌絲體的生長，這與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果一致[15]，魏龍等研究也表明中藥材中的某些成分會(huì)抑制真菌的生長發(fā)酵[7]。培養(yǎng)基含水率是影響靈芝生長發(fā)育的一個(gè)重要因素，如果培養(yǎng)基含水率過少，則會(huì)導(dǎo)致菌絲生長延緩，產(chǎn)量和品質(zhì)會(huì)大大降低；而培養(yǎng)基含水率過多，則培養(yǎng)基在高壓滅菌過程中，降低了培養(yǎng)基內(nèi)部的透氣性，使其缺少氧氣，不利于菌絲進(jìn)一步生長[16]。在本研究中，培養(yǎng)基含水率過低和過高培養(yǎng)下的靈芝菌株的抗氧化性都比較低。培養(yǎng)料滅菌是食用菌栽培中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，培養(yǎng)料滅菌必須徹底，否則會(huì)造成雜菌嚴(yán)重污染而影響菌絲的生長發(fā)育，甚至不能出菇；而滅菌時(shí)間過長，致使培養(yǎng)基中某些成分和中間代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，從而抑制微生物的新陳代謝作用[17]。在滅菌時(shí)間90min時(shí)，菌質(zhì)的抗氧化性能最大，推測(cè)原因可能是培養(yǎng)料滅菌時(shí)間較短，雜菌沒有徹底殺死，影響了靈芝菌株的生長發(fā)育，而長時(shí)間的高壓滅菌，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的成分和銀杏葉的有效成分遭到了破壞，抗氧化性能下降。

靈芝作為抗氧化性較強(qiáng)的大型真菌，多糖和三萜含量較高，銀杏葉中抗氧化物質(zhì)黃酮的含量較高，為了考察發(fā)酵后的靈芝菌株中的活性物質(zhì)是否來源于二者的雙向發(fā)酵，在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)一步測(cè)定發(fā)酵后的靈芝菌株中的多糖、三萜、黃酮。經(jīng)過銀杏葉為基質(zhì)培養(yǎng)發(fā)酵的靈芝子實(shí)體中多糖、三萜、黃酮的含量明顯增加。探討引起靈芝子實(shí)體中抗氧化性活性物質(zhì)變化的原因，可能是多種因素的綜合作用。首先，在銀杏葉作為基質(zhì)發(fā)酵靈芝的過程中，銀杏葉中的某些物質(zhì)促進(jìn)靈芝中多糖、三萜等抗氧化活性物質(zhì)的產(chǎn)生；其次，靈芝在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的酶分解銀杏組織及細(xì)胞壁中的纖維素和木質(zhì)素等大分子物質(zhì)，從而有利于銀杏多糖、黃酮等物質(zhì)的析出和游離；另外，在發(fā)酵過程中，微生物的生物轉(zhuǎn)化作用可能將其他成分轉(zhuǎn)化為多糖黃酮類物質(zhì)。

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（責(zé)編：王慧晴）