木姜葉柯紅茶的提取條件優(yōu)選研究

張亞洲1 馬建 黃帥 周福才 王強(qiáng)

摘 要：該研究選用L9（34）正交試驗(yàn)對木姜葉柯紅茶的提取條件如加水量、提取次數(shù)和提取時間進(jìn)行了考察，選用三葉苷、根皮苷和多酚作為評價指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)評分方差分析，以探索最佳提取的工藝參數(shù)。研究確定提取工藝條件優(yōu)選為A1B3C2D1，即取紅茶5g，加水量為300mL，提取3次，提取時間為20min；按以上條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，該工藝條件下根皮苷的提取轉(zhuǎn)移率為90.53%，三葉苷的提取轉(zhuǎn)移率為89.97%，多酚的提取轉(zhuǎn)移率為90.69%。該實(shí)驗(yàn)提供了對木姜葉柯紅茶的提取方法，并驗(yàn)證了方法對提取主要成分的穩(wěn)定性，為木姜葉柯紅茶的開發(fā)利用提供參考借鑒。

關(guān)鍵詞：木姜葉柯；三葉苷；根皮苷；正交提??；總多酚

中圖分類號 R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）10-0023-05

Optimization of the Extraction Condition of Mujiangyeke Black-tea

Zhang Yazhou1 et al.

（1School of Pharmacy，Guizhou Institute of Technology，Guiyang 550003，China）

Abstract：To study the boiling method of Mujiangyeke black-tea and find out the best boiling process，the orthogonal experiment was used to select the amount of water，the number of decoction and the time of boiling. The content of phlorizin，trilobatin and the total poly-phenols were selected as evaluation indexs. The boiling conditions were optimized as A1B3C2D1，that is，5 g of Mujiangyeke black-tea，adding water 300，300，300mL，boiling 3 times，boiling time 20，20，20min，respectively. According to the optimization process，the results showed that the transfer rate of phlorizin，trilobatin and total poly-phenols was 90.53%，89.97% and 90.69%，in respectively. It was suggested that boiling should be carried out according to the optimized method and which indicated that the process was stable and feasible.

Key Words：Mujiangyeke black-tea；Phlorizin；Trilobatin；Orthogonal boiling test；Total poly-phenols

木姜葉柯[Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun.]為殼斗科柯屬植物屬常綠喬木，別名甜茶、甜葉子樹、胖稠、甜味菜、大葉稠子、甘茶、多穗石柯等[1]?，F(xiàn)代研究表明，木姜葉柯中的黃酮類成分主要是根皮苷與三葉苷等二氫查爾酮類，另外還有蛋白質(zhì)、多酚和水溶性色素類成分[2-3]。木姜葉柯中的二氫查耳酮類成分主要具有降血糖，降血壓，降脂及抗過敏，抗炎等作用，尤其根皮苷在糖尿病及其并發(fā)癥的防治中具有獨(dú)特的效果[4-6]。

木姜葉柯甜茶于2017年6月獲得了國家衛(wèi)計(jì)委新食品原料批復(fù)，在民間多使用其娕葉經(jīng)加工而成的代茶飲品。為了使木姜葉柯按紅茶在提取后質(zhì)量能盡量保持一致，本研究擬通過對木姜葉柯紅茶的提取加水量、提取次數(shù)、提取時間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，找出最優(yōu)的木姜葉柯紅茶的提取條件，為木姜葉柯紅茶的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料 木姜葉柯紅茶（20170801）為廣西苷亮健生物技術(shù)公司供應(yīng)，采集于廣西南寧市南陽鄉(xiāng)木姜葉柯種植基地嫩葉按紅茶工藝加工而成（檢測含水分為10.04%；根皮苷含量為3.19%，三葉苷含量為23.39%，多酚含量為9.54%）。

1.2 試劑 乙腈（HPLC級，成都科龍?jiān)噭┯邢薰荆?；甲醇（HPLC級，成都科龍?jiān)噭┯邢薰荆涣姿幔ǚ治黾?，北京化工廠）；水為娃哈哈純凈水；根皮苷對照品>99%，三葉苷對照品>98%（均購于成都德思特生物技術(shù)公司）；沒食子酸對照品（購于中國藥品生物制品檢定所>99.5%），無水碳酸鈉（分析純，秦皇島市化學(xué)試劑廠），鎢酸鈉（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），鉬酸鈉（分析純，天津市化學(xué)試劑四廠），硫酸鋰（分析純，重慶東方試劑廠）；乙腈（HPLC級，成都科龍?jiān)噭┯邢薰荆患状迹℉PLC級，成都科龍?jiān)噭┯邢薰荆?；磷酸（分析純，北京化工廠）；水為娃哈哈純凈水。

1.3 儀器 Agilent1260series高效液相色譜儀，檢測器：1260DAD（美國安捷倫科技有限公司）；色譜柱：phenomenex，Gemini，4.6*250mm，5μm，柱號：51234-9（美國菲羅門公司）；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；鼓風(fēng)FC-881-1型熱風(fēng)循環(huán)干燥箱（吳江富成烘箱設(shè)備制造有限公司）；BSA124S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4D數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；98-1-B電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；TU-1901紫外可見分光光度儀（北京普析通用儀器有限公司）。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果分析

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[8-9] 色譜條件：通過對流動相流速、流動相組分等進(jìn)行優(yōu)化，找出較好的色譜分離條件。在流速1.0mL·min-1，A（0.1%的磷酸水溶液）：B（乙腈）進(jìn)行梯度洗脫（表1），檢測波長280nm，在根皮苷濃度：0.125mg·mL-1，三葉苷濃度：0.115mg·mL-1，20μL進(jìn)樣時，根皮苷、三葉苷能夠較好的分離，色譜條件符合相關(guān)要求（圖1、圖2、圖3）。

2.2 根皮苷、三葉苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

2.2.1 根皮苷對照品的制備 精密稱取根皮苷對照品25.0mg于20mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得A。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：分別精密吸取根皮苷對照品溶液A，4、3、2、1、0.5、0.2、0.1mL于10mL容量瓶中，用甲醇釋至刻度，搖勻，10μL進(jìn)入HPLC儀，記錄色譜圖。

2.2.2 三葉苷對照品的制備 精密稱取三葉苷對照品23.0mg于20mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得B。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：精密吸取不同濃度的三葉苷對照品B，5、4、3、2、1、0.5mL于10mL容量瓶中，用甲醇釋至刻度，搖勻，10μL進(jìn)入HPLC儀，記錄色譜圖。根皮苷、三葉苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定結(jié)果見表2。由表2可知，根皮苷進(jìn)樣濃度在0.25～5.0μg時呈現(xiàn)較好的相關(guān)性，回歸方程為C（μg）=0.000603A-0.021，相關(guān)系數(shù)r=0.9998；三葉苷濃度在0.575～5.75μg時呈現(xiàn)較好的相關(guān)性，回歸方程為C（μg）=0.00047A-0.041，相關(guān)系數(shù)r為0.9996。

2.3 多酚的含量測定

2.3.1 磷鉬鎢酸試液的配制 取鎢酸鈉100g，鉬酸鈉25g，加水700mL使溶解，加鹽酸100mL、磷酸50mL，加熱回流10hr，放冷后現(xiàn)加硫酸鋰150g，水50mL和溴0.2mL，煮沸除去殘留的溴（約15min），冷卻，加水稀釋至1000mL，濾過，即得。

2.3.2 對照溶液的配制 精密稱取沒食子酸對照品25.2mg，置25mL的棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5mL，置100mL的棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液的配制 精密稱取樣品約100mg，置100mL棕色量瓶中，加水適量，放置30min，振搖，超聲處理30min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 總酚測定 精密量取供試品溶液1mL，置25mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1mL，再分別加水11mL，用29%的碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min（以相應(yīng)的試劑為空白），照紫外—可見分光光度法在760nm的波長處測定吸光度。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，分別置25mL的棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1mL，再分別加水11.5mL、11mL、10mL、9.0mL、8mL、7mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min（以相應(yīng)的試劑為空白），照紫外—可見分光光度法在760nm的波長處測定吸光度A，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以溶液濃度C（μg）對吸收值A(chǔ)進(jìn)行線形回歸，得線形回歸方程：C=270.877A-8.307；r=0.9995；線形范圍：25.2～201.6μg時線性關(guān)系良好。

2.4 木姜葉柯紅茶的提取條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 通過選取木姜葉柯紅茶5g（根皮苷含量為3.19%，三葉苷含量為23.39%，多酚含量9.54%），分別用300mL水提取6次，每次15min，收集每次濾液，分別精密移取5mL至25mL量瓶中，用水稀釋至刻度，采用0.45μm微孔濾膜過濾，得濾液，搖勻，HPLC儀10μL分別進(jìn)樣，每次相關(guān)成分含量見表3。由表3可知，提取3次后，根皮苷已轉(zhuǎn)移達(dá)到80.88%，三葉苷轉(zhuǎn)移已達(dá)到77.85%，多酚轉(zhuǎn)移已達(dá)到90.25%。故認(rèn)為在提取次數(shù)上選擇3次已較合適。

2.5 正交實(shí)驗(yàn) 通過選取木姜葉柯紅茶，對其提取時的加水量、提取次數(shù)、提取時間進(jìn)行相關(guān)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考查，優(yōu)選最佳提取條件。每次取木姜葉柯紅茶（1）5g，影響提取的主要因素有加入水量、提取次數(shù)和提取時間，上述3個因素各取3個水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)見表4，提取溶液備用。

選用根皮苷、三葉苷和多酚作為提取工藝的評價指標(biāo)，對相關(guān)指標(biāo)用加權(quán)評分法進(jìn)行方差分析。確定根皮苷含量權(quán)重0.4，三葉苷含量權(quán)重0.4，多酚含量權(quán)重0.2；分別以根皮苷、三葉苷和多酚中最高測量值為滿分100，其它均通過與最高得分進(jìn)行換算（每項(xiàng)評分得分為=單項(xiàng)測量值/單項(xiàng)最高值*權(quán)重分值）。正交提取試驗(yàn)結(jié)果見表5～7。

由表5～7可知，對木姜葉柯紅茶中根皮苷、三葉苷和多酚加權(quán)評分方差分析結(jié)果說明，提取影響因素大小是：提取次數(shù)>提取時間>加水量，方差分析結(jié)果顯示提取次數(shù)有極顯著性的影響。結(jié)合直觀分析綜合結(jié)果考慮，對木姜葉柯紅茶最后提取工藝確定為A1B3C2D1，即每次提取加水量為300mL，提取3次，提取時間為20min。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 木姜葉柯紅茶提取方法，既每次提取加水量為300mL，提取3次，提取時間分別為20min，從根皮苷含量、三葉苷含量指標(biāo)考察，重復(fù)平行3次。從根皮苷含量、三葉苷和多酚含量指標(biāo)考察，結(jié)果均重復(fù)性較好，根皮苷的提取轉(zhuǎn)移率為90.53%（RSD為2.28%，n=3）；三葉苷的提取轉(zhuǎn)移率為89.97%（RSD為1.72%，n=3）；多酚的提取轉(zhuǎn)移率為90.69%（RSD為1.88%，n=3）。

3 結(jié)論與討論

由于傳統(tǒng)茶葉泡制時間上較不統(tǒng)一，飲用者飲用不同時間或泡制次數(shù)的茶水其質(zhì)量存在較大差異。為使開發(fā)出的茶飲料每次質(zhì)量能盡量保持一致和可控，木姜葉柯紅茶通過對其提取的加水量（加水量設(shè)定為約一杯水的量300～500mL；水溫約98～100℃）、提取次數(shù)、提取時間進(jìn)行優(yōu)化，從而找出最優(yōu)的使用條件。

現(xiàn)在通過對木姜葉柯紅茶的提取條件進(jìn)行考查，采用根皮苷、三葉苷為指標(biāo)進(jìn)行評價，最后確定木姜葉柯紅茶提取條件確定為，取紅茶5g，加水量300mL量，分別提取3次，每次提取時間為20min時，飲用時保留了較合適的根皮苷、三葉苷和多酚成分。

通過實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，木姜葉柯紅茶在提取過程中，提取后一般第1次（共6次）最容易變質(zhì)（20～24h時內(nèi)）且第1次提取的茶水放冷后下喉時有微澀味（40℃以上飲用可減弱），后面提取的2～6次均在放冷時仍保持有一定的甜味，微澀味減弱，并且不容易變質(zhì)（一般可放置3～4d）；通過紅茶提取5min后發(fā)現(xiàn)，在黃酮類成分浸出較少的情況下，可以較大程度除去可能引起變質(zhì)和微澀味的蛋白質(zhì)、多酚和水溶性色素等成分。

木姜葉柯一般主要用途為每年4—9月份采集其嫩葉加工成茶的形式葉使用，其黃酮類成分一般認(rèn)為為根皮苷、三葉苷和根皮素，而根皮素在葉中含量較低，未能同時與根皮苷、三葉苷進(jìn)行含量分析方法的建立。本研究中選用的根皮苷、三葉苷和多酚作為評價指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)評分方差分析確定木姜葉柯紅茶的提取工藝，為其開發(fā)利用提供了較好的參考。

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（責(zé)編：張宏民）