ZEB1在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義

楊盛蘭，閔江

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，重慶 400016）

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）是消化道最常見的間葉來源的腫瘤，約占消化道腫瘤的1%-3%[1]。GIST幾乎發(fā)生于胃腸道的任何部位，其中約60%發(fā)生于胃，約30%發(fā)生于小腸，約5%發(fā)生于十二指腸，約4%發(fā)生于直腸，約1%發(fā)生于食管，約2%發(fā)生于結(jié)腸及闌尾[2]。和其他上皮腫瘤不同，腫瘤大小和核分裂像是評價GIST危險度的兩個最重要的病理特征，然而上述兩個因素仍無法完整的預(yù)測GIST的惡性潛能[3-4]。

GIST被認(rèn)為起源于Cajal 細(xì)胞同源的葉間干細(xì)胞，約95%的GIST表達(dá)KIT（CD117）[5]。絡(luò)氨酸激酶是促進(jìn)GIST發(fā)生和發(fā)展的重要信號通路，KIT是該信號通路的“開關(guān)蛋白”。約80%的GIST有KIT基因的突變，另外，5%～10%的GIST有PDGFRA的突變，二者均可導(dǎo)致絡(luò)氨酸激酶信號途徑的持續(xù)性活化，因此突變的KIT和PDGFRA是GIST診斷的重要依據(jù)，也是GIST治療的重要靶點，與病人的預(yù)后相關(guān)[6-9]。同時，還有一些研究發(fā)現(xiàn)CDKN2A和p53這兩個腫瘤抑制基因的失活突變與GIST的惡性病理特征呈負(fù)相關(guān)[10-13]。此外，抑癌蛋白dystrophins的失活與GIST的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有重要的相關(guān)性[14-16]。然而，能有效預(yù)測GIST惡性潛能和預(yù)后的分子仍較少。E盒鋅指結(jié)合蛋白1（zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1）是鋅指蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，可參與結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌等多種上皮來源腫瘤轉(zhuǎn)移[17-19]，但在間質(zhì)來源細(xì)胞腫瘤中的作用還不完全清楚。我們前期小樣本初染中發(fā)現(xiàn)，在不同GIST組織標(biāo)本中，ZEB1的表達(dá)存在差異，但這種差異性表達(dá)的規(guī)律以及臨床意義還不清楚。本研究通過選取較大樣本的GIST臨床石蠟標(biāo)本，通過免疫組織化學(xué)方法檢測GIST中ZEB1表達(dá)，分析其與GIST的臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，探尋ZEB1與GIST患者預(yù)后的關(guān)系。

材料與方法

1 標(biāo)本來源

收集97例自2011年以來在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科行手術(shù)治療的胃腸間質(zhì)瘤病人的術(shù)后病理標(biāo)本的石蠟切片，并隨訪病理信息及患者術(shù)后狀況。該研究符合重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并通過該委員會批準(zhǔn)，所有受試對象術(shù)前均簽署知情同意書。所有病員術(shù)前未行伊馬替尼治療，均為單發(fā)可切除的間質(zhì)瘤患者。所有腫瘤切緣術(shù)后均證實為陰性。所有標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)過常規(guī)病理分析及c-KIT基因突變檢測最終證實為間質(zhì)瘤。采用2013版中國胃腸道間質(zhì)瘤病理診斷治療共識推薦的NIH2008年改良版對腫瘤的危險度進(jìn)行分級。

2 免疫組織化學(xué)染色

將準(zhǔn)備好的石蠟組織切片（5μm）置于60℃溫箱中約1h后二甲苯 I、II各10min脫蠟；100%、95%、80%、70%酒精各2min，蒸餾水洗5min×2次（于搖床上）；3%H2O2室溫10min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶；抗原修復(fù)：枸櫞酸鈉緩沖液（10mmol/L，pH6.0），淹沒切片，蓋上鍋蓋，高壓鍋內(nèi)煮沸，上汽3min后緩慢冷卻；PBS洗5min×2后加山羊血清室溫封閉30min；滴加鼠抗人ZEB1抗體（1∶200；Sigma），4℃過夜；PBS洗5min×2后滴加Envision二抗（GeneTech），37℃孵育30min；PBS洗5min×2后DAB顯色約1min；去離子水終止顯色，蘇木素復(fù)染20s，鹽酸酒精分化5s；自來水沖洗15min返藍(lán)；梯度酒精脫水：依次80%和95%酒精各1min，100%酒精2min；二甲苯 I、II各10min透明；中性樹脂封片。以已知強(qiáng)陽性染色的組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

3 結(jié)果判定

所有樣本隨機(jī)對照，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。染色強(qiáng)度分級計分標(biāo)準(zhǔn)： 0分（無染色）、1分（淡黃色）、2分（黃色或深黃色）、3分（褐色或棕褐色）。陽性細(xì)胞計分標(biāo)準(zhǔn)為： 0分（≤5%）、1分（5%～25%）、2分（25%～50%）、3分（50%～75%），4分（＞75%）。兩者計分的乘積作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，0～4分為低表達(dá)，4～12 分為高表達(dá)。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有統(tǒng)計分析使用軟件SPSS16.0，卡方檢驗用于評估ZEB1表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性。利用Kaplan-Meier法對患者進(jìn)行疾病無進(jìn)展生存時間分析。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

1 ZEB1在GIST中存在差異性的表達(dá)

對97例GIST的石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，ZEB1均表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)，且表達(dá)量存在明顯的差異，其中43例為高表達(dá)，而剩余54例為低表達(dá)（圖1）。

圖1 ZEB1在GIST內(nèi)的差異性表達(dá)。A，高表達(dá)病例；B，低表達(dá)病例；比例尺，25μmFig.1 Differential expression of ZEB1 in GIST stained by IHC.A, high expression; B, low expression; scale bar, 25μm

2 GIST中ZEB1的表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系

對ZEB1的表達(dá)強(qiáng)弱與GIST的病理特征以及危險度進(jìn)行相關(guān)分析顯示，ZEB1的高表達(dá)與較多的核分裂像呈正相關(guān)（P=0.032）；較高的ZEB1表達(dá)提示更高的危險度（P=0.007）；ZEB1的表達(dá)與患者的年齡、性別，腫瘤發(fā)生部位及腫瘤大小無相關(guān)性（表1）。進(jìn)一步分析ZEB1的表達(dá)與術(shù)后患者的疾病無進(jìn)展生存時間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：ZEB1表達(dá)越高的患者其無進(jìn)展生存時間就越短（P＜0.01)（圖2）。

表1 ZEB1表達(dá)水平與GIST的臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 Relationship between ZEB1 expression level and clinicopathologic features of GIST

圖2 ZEB1表達(dá)水平與GIST術(shù)后疾病無進(jìn)展生存時間相關(guān)。ZEB1高表達(dá)患者的無進(jìn)展生存時間遠(yuǎn)低于ZEB1低表達(dá)者Fig.2 The positive correlation between ZEB1 expression and prognosis of GISTs.The progression-free survival time in patients with high ZEB1 expression was significantly shorter than that of patients with low expression

討 論

對于大多數(shù)的GIST患者，盡管基于手術(shù)和靶向藥物伊馬替尼的聯(lián)合治療已大大提高了其生存的時間，但仍有許多患者死于腫瘤的局部復(fù)發(fā)和難以控制的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。以往的研究證實，ZEB1是調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）的重要分子，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換在腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中均有重要的作用。ZEB1作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，一方面可直接抑制細(xì)胞黏附分子E-Cadherin的表達(dá)[20]，另一方面通過抑制某些促進(jìn)上皮分化的分子的表達(dá)，如miR-183、miR-203和 miR-200家族等[21]，最終促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生。此外，ZEB1調(diào)節(jié)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換可使腫瘤細(xì)胞獲得“干細(xì)胞特性”從而更容易復(fù)發(fā)[22]。因此，ZEB1被認(rèn)為是上皮腫瘤進(jìn)展和較差預(yù)后的預(yù)測因子。本研究通過免疫組織化學(xué)染色證實：ZEB1在間質(zhì)細(xì)胞中也存在類似于上皮細(xì)胞的作用，高表達(dá)ZEB1的患者有更短的無進(jìn)展生存時間，由此表明，無論在上皮細(xì)胞還是GIST中，ZEB1均能預(yù)測患者的預(yù)后。

核分裂像和腫瘤大小是GIST重要的病理特征，直接決定著GIST的危險度及發(fā)生轉(zhuǎn)移的幾率。我們的研究還發(fā)現(xiàn)ZEB1的表達(dá)與核分裂像呈正相關(guān)。核分裂像反應(yīng)腫瘤當(dāng)前的分裂狀況，它與腫瘤的增殖相關(guān)，因此ZEB1可能參與了GIST腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。然而，ZEB1和腫瘤的大小無相關(guān)性，可能存在其他機(jī)制拮抗ZEB1的生長效應(yīng)。

由此可見，ZEB1可有效的預(yù)測GIST患者的預(yù)后，而ZEB1在GIST中的作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

[1]Hirota S, Isozaki K, Moriyama Y, et al.Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors.Science, 1998, 279(5350)∶ 577-580.

[2]Miettinen M, Lasota J.Gastrointestinal stromal tumors∶ pathology and prognosis at different sites.Semin Diagn Pathol,2006, 23(2)∶ 70-83.

[3]Siegel RL, Miller KD, Jemal A.Cancer Statistics, 2017.CA Cancer J Clin, 2017, 67(1)∶ 7-30.

[4]D’Amato G, Steinert DM, McAuliffe JC, et al.Update on the biology and therapy of gastrointestinal stromal tumors.Cancer Control, 2005, 12(1)∶ 44-56.

[5]Kindblom LG, Remotti HE, Aldenborg F, et al.Gastrointestinal pacemaker cell tumor (GIPACT) gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal.Am J Pathol, 1998, 152(5)∶ 1259-1269.

[6]Singer S, Rubin BP, Lux ML, et al.Prognostic value of KIT mutation type, mitotic activity, and histologic subtype in gastrointestinal stromal tumors.J Clin Oncol, 2002, 20(18)∶3898-3905.

[7]Lasota J, Jasinski M, Sarlomo-Rikala M, et al.Mutations in exon 11 of c-kit occur preferentially in malignant versus benign gastrointestinal stromal tumors and do not occur in leiomyomas or leiomyosarcomas.Am J Pathol, 1999,154(1)∶ 53-60.

[8]Beghini A, Tibiletti MG, Roversi G, et al.Germline mutation in the juxtamembrane domain of the kit gene in a family with gastrointestinal stromal tumors and urticaria pigmentosa.Cancer, 2001, 92(3)∶ 657-662.

[9]Roskoski R, Jr.Structure and regulation of Kit protein-tyrosine kinase—the stem cell factor receptor.Biochem Biophys Res Commun, 2005, 338(3)∶ 1307-1315.

[10]Schneider-Stock R, Boltze C, Lasota J, et al.High prognostic value of p16INK4 alterations in gastrointestinal stromal tumors.J Clin Oncol, 2003, 21(9)∶ 1688-1697.

[11]Ricci R, Arena V, Castri F, et al.Role of p16/INK4a in gastrointestinal stromal tumor progression.Am J Clin Pathol,2004, 122(1)∶ 35-43.

[12]Feakins RM.The expression of p53 and bcl-2 in gastrointestinal stromal tumours is associated with anatomical site,and p53 expression is associated with grade and clinical outcome.Histopathology, 2005, 46(3)∶ 270-279.

[13]Henze J, Muhlenberg T, Simon S, et al.p53 modulation as a therapeutic strategy in gastrointestinal stromal tumors.PLoS One, 2012, 7(5)∶ e37776.

[14]Wang Y, Marino-Enriquez A, Bennett RR, et al.Dystrophin is a tumor suppressor in human cancers with myogenic programs.Nat Genet, 2014, 46(6)∶ 601-606.

[15]Adamo CM, Dai DF, Percival JM, et al.Sildenafil reverses cardiac dysfunction in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy.Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(44)∶ 19079-19083.

[16]Wang Y, Fletcher JA.Cell cycle and dystrophin dysregulation in GIST.Cell Cycle, 2015, 14(17)∶2713-2714.

[17]Pe?a C, García JM, Silva J, et al.E-cadherin and vitamin D receptor regulation by SNAIL and ZEB1 in colon cancer∶clinicopathological correlations.Hum Mol Genet, 2005,14(22)∶ 3361-70.

[18]Pe?a C, García JM, García V, et al.The expression levels of the transcriptional regulators p300 and CtBP modulate the correlations between SNAIL, ZEB1, E-cadherin and vitamin D receptor in human colon carcinomas.Int J Cancer,2006, 119(9)∶ 2098-104.

[19]Dohadwala M, Yang SC, Luo J, et al.Cyclooxygenase-2-dependent regulation of E-cadherin∶ prostaglandin E(2) induces transcriptional repressors ZEB1 and snail in non-small cell lung cancer.Cancer Res, 2006, 66(10)∶ 5338-45.

[20]Eger A, Aigner K, Sonderegger S, et al.DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells.Oncogene, 2005, 24(14)∶2375-85.

[21]Wellner U, Schubert J, Burk UC, et al.The EMT-activator ZEB1 promotes tumorigenicity by repressing stemness-inhibiting microRNAs.Nat Cell Biol, 2009, 11(12)∶ 1487-1495.

[22]Burk U, Schubert J, Wellner U, et al.A reciprocal repression between ZEB1 and members of the miR-200 family promotes EMT and invasion in cancer cells.EMBO Rep, 2008,9(6)∶ 582–589.