HSF1基因敲除小鼠心臟老化淀粉樣變模型建立與檢測(cè)

袁潘攀，陳詩(shī)琦，楊亞儒，王艷軍，李瑞琛，錢俊喬，霍佳，李陳莉 ，錢金澤*

（1河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，河北省腎臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050017；2 河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口外科，石家莊 050000；3 河北醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院骨病科，石家莊 050000；4 河北醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 石家莊 0500175；5石家莊醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系，石家莊 050000 ）

淀粉樣變性是一組由于蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊引起的，以淀粉樣蛋白纖維沉積于各種組織的間質(zhì)為特征，并引發(fā)多系統(tǒng)損害的全身性疾病。目前，已發(fā)現(xiàn)超過(guò)30種不同的前體蛋白可在人類及其他動(dòng)物活體中形成淀粉樣蛋白，并伴隨正常組織結(jié)構(gòu)和功能的破壞，導(dǎo)致相應(yīng)器官功能障礙等病理改變，如朊毒體病（prion diseases），阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease），II型糖尿病，家族性淀粉樣變性多神經(jīng)?。╢amilial amyloid polyneuropathy , FAP）等[1]。臨床上，心臟淀粉樣變主要有3種：原發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變蛋白（acquired monoclonal immunoglobulin lightchain amyloidoses, AL）相關(guān)淀粉樣變、家族性甲狀腺素蛋白（hereditary transthyretin, TTR）相關(guān)淀粉樣變和老化淀粉樣變（senile amyloidosis）。載脂蛋白A-II（apoA-II）是血清高密度脂蛋白的第二大主要組成成分，存在于人類、小鼠、大鼠和魚的血漿中[2，3]，并通過(guò)蛋白異常折疊等方式形成AApoAII淀粉樣纖維沉積于腦實(shí)質(zhì)和骨髓以外幾乎所有的器官組織器官之中，引起老化淀粉樣變疾?。╩ouse senile amyloidosis）[4]。熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock factor 1, HSF1）作為調(diào)節(jié)熱休克蛋白表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體老化過(guò)程中其活性逐漸降低[5]，并可被熱休克、氧化應(yīng)激、缺血／氧、重金屬等多種應(yīng)激因素激活，通過(guò)與DNA上的熱休克元件（heat shock element, HSE）的結(jié)合，繼而誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)[6]。此外，HSF1還與蛋白質(zhì)折疊/聚集密切相關(guān)，可以有效的防治朊病毒疾病[7], 多谷氨酰胺蛋白（polyglutamine proteins）以及FAP等蛋白質(zhì)異常折疊 /聚集引起的疾病[8，9，10]。

目前，尚無(wú)心臟淀粉樣變動(dòng)物模型的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)使用HSF1敲除小鼠構(gòu)建老化淀粉樣變模型，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法觀察心臟及其他組織淀粉樣變的情況，以期為心臟淀粉樣變研究中合適動(dòng)物模型的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

Hsf1敲除小鼠由日本山口大學(xué)大學(xué)院醫(yī)學(xué)系研究科醫(yī)化學(xué)系中井彰教授贈(zèng)予。本實(shí)驗(yàn)采用2月齡的雌性小鼠，分4個(gè)實(shí)驗(yàn)組：野生型ICR小鼠作為空白對(duì)照組，Hsf1敲除小鼠作為空白對(duì)照組，野生型淀粉樣變模型組，敲除型淀粉樣變模型組。

2 模型制備

參照Pras’的方法，從淀粉樣變誘導(dǎo)后2個(gè)月的ICR小鼠肝中提取AApoAII淀粉樣纖維種子[12]，并用蒸餾水稀釋濃度至1.0mg/mL。將稀釋液用超聲處理后，采用尾靜脈注射法進(jìn)行淀粉樣變模型制備，各模型組小鼠注射量為100μg。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2個(gè)月后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 組織標(biāo)本的取材

待淀粉樣變誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2個(gè)月后即取材。對(duì)手術(shù)器械、手術(shù)操作臺(tái)及小鼠進(jìn)行消毒，用乙醚對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行麻醉，心臟取血，4℃靜至30min，3000r/min離心15min，收集血清；取肝臟、心臟、脾臟、皮膚、舌、腸、胃分別置于4%多聚甲醛及2.5%的戊二醛中，以做光鏡及透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察。取各個(gè)臟器組織置于液氮中，以做蛋白定量。

4 心臟組織的形態(tài)學(xué)觀察

剛果紅染色：石蠟切片脫蠟至水；蘇木素染核1min，水洗，藍(lán)化；剛果紅工作液（剛果紅0.02g，氯化鈉0.6g，80%乙醇100mL）染30min；入100%乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。偏光顯微鏡觀察淀粉樣沉積程度。

ApoA-II免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片脫蠟至水；微波抗原修復(fù)；3%H2O2室溫孵育10min；PBS沖洗（3min×3次）；正常山羊血清封閉液，室溫孵育15min；apoA-II抗體（1∶3000, 自制）室溫孵育1h；PBS沖洗（3min×3次）；滴加生物素化二抗工作液，室溫孵育60min；PBS沖洗（3min×3次）；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育60min；PBS沖洗（3min×3次）；H2O2-DAB顯色；流水沖洗5～10min；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

電鏡標(biāo)本制備：將2.5%的戊二醛固定好的組織樣品用0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，并用1%鋨酸固定液固定。經(jīng)乙醇、丙酮脫水后進(jìn)行包埋、固化。超薄切片(60～700nm)，并用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，隨后使用JEM-1400 電子顯微鏡(JEOL,Tokyo, Japan, 80 kV) 進(jìn)行電鏡觀察。

Masson染色：使用Masson三色染色液（PhygeneTM，PH0622）試劑盒。切片常規(guī)脫蠟至水；鐵蘇木素染液染色5min，酸性乙醇分化液分化、水洗；氨水溶液返藍(lán)、水洗；蒸餾水洗1min；麗春紅品紅染色液染10min；乙酸溶液洗1min；磷鉬酸溶液洗1min；乙酸溶液洗1min；直接放入苯胺藍(lán)染色液中染色1min；乙酸溶液洗1min；95%乙醇快速脫水；入100%乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

5 淀粉樣變沉積程度評(píng)估

根據(jù)淀粉樣蛋白指數(shù)（Amyloid Index）評(píng)估心、肝、脾、胃、腸、舌、皮各組織淀粉樣變沉積程度,分為0-4級(jí)：0級(jí)，無(wú)淀粉樣沉積物；1級(jí)，約＜10%的組織中可見淀粉樣沉積物；2級(jí)，約10%～30%的組織中可見淀粉樣沉積物；3級(jí)，30%～50%的組織中可見淀粉樣沉積物；4級(jí)，＞50%的組織中可見淀粉樣沉積物。淀粉樣變沉積程度為0級(jí)以上即為造模成功[13]。

6 Western blot法檢測(cè)血清中心肌肌鈣蛋白T（cTnT）及心肌組織中α-actin的表達(dá)情況

采用SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。轉(zhuǎn)膜后分別用cTnT（ProteintechTM, 1∶200）和α-actin（Sigma-Aldrich;1∶5000）抗體檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料。

使 用 StatView software package （Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA）軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)Mann-Whitney U-test進(jìn)行相關(guān)分析。

結(jié) 果

1 Hsf1基因敲除抑制淀粉樣變誘導(dǎo)的心肌組織中熱休克蛋白水平上調(diào)

淀粉樣變誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)后，Hsf1-/-小鼠模型組心肌組織中的熱休克蛋白HSPB1、HSPA1A、HSPC1表達(dá)水平無(wú)明顯變化，DNAJB1水平略有升高但無(wú)顯著差異；而Hsf1+/+小鼠模型組心肌組織中的熱休克蛋白HSPB1、HSPA1A、HSPC1和DNAJB1表達(dá)水平均顯著增加（圖1），提示在心肌組織中，淀粉樣物質(zhì)沉積可以誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)，而由于Hsf1基因的缺失，則不能有效誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)。

圖1 Western blot檢測(cè)Hsf1基因敲除對(duì)淀粉樣變誘導(dǎo)上調(diào)心肌組織中熱休克蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Western blot detection on the effect of Hsf1 gene knock-out on amyloidosis-induced upregulation of heat shock protein expressions in cardiac tissues

2 Hsf1基因敲除加劇心臟淀粉樣變程度

根據(jù)Amyloid Index，淀粉樣變誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2個(gè)月后，Hsf1-/-小鼠模型組系統(tǒng)性淀粉樣變沉積程度顯著高于野生型模型組小鼠，其中心肌組織中淀粉樣物質(zhì)沉積程度在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的差異最為顯著（圖2）。

圖2 心肌組織的淀粉樣蛋白指數(shù)。Hsf1-/-小鼠心臟組織中淀粉樣物質(zhì)沉積程度顯著增高；*0.01＜P＜0.05，**P＜0.01Fig.2 Amyloid Index of cardiac tissues.Amyloidosis significantly increased in the heart of Hsf1-deficient mice; *0.01＜P＜0.05; **P＜0.01

剛果紅染色及免疫組織化學(xué)染色顯示AApoAII淀粉樣纖維主要沉積在心肌間質(zhì)組織和毛細(xì)血管壁上，且Hsf1-/-敲除型小鼠模型組的淀粉樣物質(zhì)顯著多于野生型模型組（圖3）。

電鏡觀察顯示，在心肌組織血管壁上及間質(zhì)組織可見直徑約為8～10nm的纖維結(jié)構(gòu)（圖4）。

3 Hsf1基因敲除加劇淀粉樣變誘導(dǎo)的心肌纖維化

Masson’s trichrome染色顯示，淀粉樣變誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)后，Hsf1-/-小鼠心肌纖維化程度顯著高于野生型小鼠, 但心肌細(xì)胞的大小并無(wú)明顯改變（圖5）。

4 Hsf1缺失加劇淀粉樣變誘導(dǎo)的心肌組織中αactin水平下調(diào)及血清中cTnT水平上調(diào)

α-actin作為心肌細(xì)胞骨架蛋白之一，其表達(dá)量的變化直接影響心肌細(xì)胞的收縮及舒張功能；cTnT是心肌細(xì)胞特有的抗原之一，在心肌細(xì)胞損傷時(shí)從心肌纖維上降解下來(lái)，而血清中cTnT升高反映了心肌細(xì)胞受損，是心肌細(xì)胞損傷壞死的標(biāo)志物。淀粉樣變誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)后，Hsf1-/-小鼠與野生型小鼠心肌組織中α-actin水平均有不同程度降低，其中Hsf1-/-小鼠心肌組織中α-actin水平降低最為顯著；Hsf1-/-小鼠與野生型小鼠血清中cTnT水平均有不同程度增高，其中Hsf1-/-小鼠血清中cTnT水平升高最為顯著。因此，Hsf1的缺失加劇了淀粉樣變對(duì)心肌細(xì)胞的損傷（圖6）。

圖4 心臟組織中淀粉樣沉積的電鏡觀察。A，毛細(xì)血管壁；B，間質(zhì)；C，淀粉樣纖維；比例尺：A，0.2μm；B，0.5μm；C，0.1μmFig.4 Detection of amyloid fibrils in cardiac tissue by transmission electron microscopy.A, capillary walls; B, mesenchyme; C, amyloid fibrils; scale bar, A, 0.2μm; B, 0.5μm; C, 0.1μm

討 論

淀粉樣變性是一組由遺傳、變性和感染等不同因素引起，因蛋白質(zhì)分子折疊異常所致淀粉樣物質(zhì)沉積的綜合征，所形成的不溶性的淀粉樣物質(zhì)主要沉積于全身細(xì)胞外組織間隙，從而導(dǎo)致相應(yīng)器官或組織功能障礙。心臟是淀粉樣變性常累及的器官，大量不溶性的淀粉樣纖維沉積在心肌組織內(nèi)，最終導(dǎo)致心肌功能損傷[13]。盡管國(guó)內(nèi)外均有心臟淀粉樣變的研究報(bào)道，但尚未有心臟淀粉樣變動(dòng)物模型的相關(guān)報(bào)道。本研究采用Hsf1-/-小鼠，構(gòu)建心臟淀粉樣變動(dòng)物模型，為心臟淀粉樣變的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了有力的實(shí)驗(yàn)技術(shù)支持。

圖5 Masson’s trichrome染色檢測(cè)Hsf1敲除對(duì)淀粉樣變誘導(dǎo)小鼠心肌纖維化的影響。比例尺，50μm；*0.01＜P＜0.05;**P＜0.01Fig.5 Masson’s trichrome staining examination of cardiac fibrosis induced by amyloidosis.Scale bar, 50μm; *0.01＜P＜0.05; **P＜0.01

有報(bào)道指出，上調(diào)HSF1的表達(dá)可以改善由慢性壓力過(guò)負(fù)荷所致的心肌纖維化、心肌細(xì)胞壞死、心功能不全及心臟的適應(yīng)性肥大，而抑制HSF1的表達(dá)則加劇了由慢性壓力過(guò)負(fù)荷所致的心臟功能損傷[14]。在本研究中，淀粉樣變誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2個(gè)月后，野生型小鼠心肌組織中熱休克蛋白（HSPB1、HSPA1A、DNAJB1）的表達(dá)明顯升高，而Hsf1-/-小鼠心肌組織中熱休克蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化，提示由于Hsf1缺失淀粉樣物質(zhì)沉積不能有效激活具有保護(hù)作用的熱休克蛋白。根據(jù)Amyloid Index，淀粉樣變誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2個(gè)月后，Hsf1-/-小鼠模型組心臟組織中淀粉樣物質(zhì)沉積程度顯著高于野生型模型組小鼠，其他臟器組織的淀粉樣沉積物質(zhì)的沉積程度在Hsf1-/-小鼠和野生型小鼠模型組未見明顯差異；淀粉樣物質(zhì)的沉積部位主要位于小血管壁及細(xì)胞外的間質(zhì)組織中；電鏡觀察可見間質(zhì)組織及血管壁上，直徑約為8～10nm纖維結(jié)構(gòu)。由于淀粉樣物質(zhì)的沉積，導(dǎo)致了心肌組織纖維化，并且Hsf1-/-小鼠模型組心肌纖維化程度顯著高于野生型小鼠。α-actin是心肌細(xì)胞的主要骨架蛋白，cardiac troponin T是心肌損傷的首選生化標(biāo)記物，通過(guò)對(duì)心臟組織中α-actin及血清中cTnT蛋白的表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，淀粉樣物質(zhì)沉積導(dǎo)致了心臟組織中α-actin表達(dá)降低，血清中cTnT表達(dá)升高，Hsf1?/?的缺失進(jìn)一步加劇了α-actin表達(dá)降低和cTnT表達(dá)升高，此結(jié)果與臨床上心肌淀粉樣變的血清學(xué)特征相符[15]。

圖6 Hsf1缺失對(duì)淀粉樣變誘導(dǎo)的心肌組織中α-actin水平下調(diào)及血清中cTnT上調(diào)的影響。Fig.6 Western blot analysis on the effect of Hsf1 deficiency on the downregulation of cardiac α-actin and upregulation of serum cardiac troponin T induced by amyloidosis.

本研究利用Hsf1-/-小鼠構(gòu)建小鼠老化淀粉樣變模型，發(fā)現(xiàn)了由于Hsf1缺失加劇了心臟組織的淀粉樣物質(zhì)沉積程度，并導(dǎo)致了由老化淀粉樣纖維沉積所致的心臟功能損傷。因此，該模型可用于心臟淀粉樣變的基礎(chǔ)理論研究，為臨床上心臟淀粉樣變的防治提供新的理論依據(jù)。

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