MiR-706通過(guò)TAOK1信號(hào)通路抑制小鼠肝纖維化

張舒嫻，謝川平，張秀英*，周德山*

（首都醫(yī)科大學(xué)1人體解剖與組織胚胎學(xué)系，2臨床醫(yī)學(xué)長(zhǎng)學(xué)制2015級(jí)， 北京 100069）

慢性病毒性肝炎、脂肪肝、酒精及慢性脂肪型肝病、藥物以及毒物等慢性損傷刺激肝臟，引起炎癥反應(yīng)，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）合成降解與沉積不平衡后形成肝纖維化，進(jìn)而會(huì)發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭[1]。肝纖維化是一種可逆性病變, 發(fā)展至肝硬變則不可逆。在某些情況下, 肝移植術(shù)可治愈終末期肝病,但缺乏供體、費(fèi)用昂貴及受體體質(zhì)差等因素嚴(yán)重限制了這一技術(shù)的應(yīng)用。因此阻斷肝纖維化像肝硬化進(jìn)展，并加強(qiáng)肝纖維化研究與防治更具有重要的實(shí)際意義，也是當(dāng)今國(guó)際肝病界研究之熱點(diǎn)。

MicroRNA是小RNA的最主要組成部分，與小干涉RNA一樣，能序列特異性地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)。MicroRNA在核內(nèi)形成，經(jīng)過(guò)一系列的剪切和運(yùn)輸后形成成熟的約有22nt的非編碼RNA，進(jìn)而與下游靶基因的3’UTR區(qū)部分或完全配對(duì)結(jié)合，通過(guò)降低靶mRNA的穩(wěn)定性或抑制翻譯而下調(diào)目的基因的表達(dá)。 MicroRNA對(duì)某種特定基因產(chǎn)生的直接靶向抑制作用為某些疾病的治療提供了大量的分子生物學(xué)依據(jù)[2-4]。

有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPKs）通路是細(xì)胞內(nèi)最主要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，主要由以下3個(gè)途徑組成：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、蛋白調(diào)節(jié)激酶p38（P38MAPK）和cjun末端調(diào)節(jié)激酶（JNK）。其中，p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路作為MAPK家族中重要的成員，其在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及氧化應(yīng)激反應(yīng)等方面都發(fā)揮著重要的作用[5]。近年來(lái)，有研究表明，p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路可能通過(guò)誘導(dǎo)HSC的活化、增殖促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[6]，且TGF-β可調(diào)控p38MAPK途徑，進(jìn)而激活下游的Smad3通路，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的分泌及膠原的沉積[7]。而TAOK1作為p38/MAPK14轉(zhuǎn)錄激活因子，可以應(yīng)激性活化下游的MAPK信號(hào)通路，加速肝纖維化的形成[8,9]。前期工作中，我們通過(guò)基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在小鼠CCl4肝纖維化組織中miR-706表達(dá)顯著低；并且通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因證明miR-706可通過(guò)與下游靶基因的3’UTR區(qū)部分配對(duì)結(jié)合，抑制TAOK1基因的表達(dá)[10]。而膽總管結(jié)扎（bile duct ligation，BDL）肝纖維化模型不同于CCl4肝纖維化模型，其主要通過(guò)結(jié)扎所引起的膽道梗阻，膽管擴(kuò)張壓迫肝內(nèi)血管，肝細(xì)胞缺血壞死，膠原大量沉積而引發(fā)纖維組織出現(xiàn)大量增生，并包繞肝小葉，形成肝纖維化[11]。本研究我們將在小鼠BDL肝纖維化模型中，分析miR-706下游靶基因TAOK1所調(diào)控的信號(hào)通路中相關(guān)因子的變化，明確miR-706是否在膽汁淤積性肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK20120001）于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部購(gòu)置，雄性，體重約18～22g，6～8周齡，在SPF級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物房飼養(yǎng)。

2 主要試劑

Masson試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RNA提取試劑盒（Invitrogen）；micro-RNA莖環(huán)引物（生物工程有限公司）；micro-RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（taqman）；SYBER Green Mix Real-time PCR試劑盒及96孔板（Invitrogen）；BCA試劑盒（Thermo）；兔抗TAOK1多克隆抗體（Cell Signaling）；鼠抗α-SMA單克隆抗體（Sigma）；鼠抗p38、MEK3多克隆抗體（Abcam）；兔抗Collagen I多克隆抗體（Abcam）；兔抗β-actin多克隆抗體（Cell Signaling）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體（Cell Signaling）；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體（Cell Signaling）；免疫組織化學(xué)試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；ECL顯色試劑盒（美國(guó)Bio-Rad公司）。

3 BDL肝纖維化模型建立

將20只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組和BDL肝纖維化模型組（BDL組）兩組，每組10只小鼠。對(duì)BDL組小鼠以4% 水合氯醛麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)，剖腹后分開(kāi)肝葉，將膽囊與十二指腸相連的小管（膽總管）分離結(jié)扎，縫合關(guān)腹；對(duì)假手術(shù)組小鼠麻醉后打開(kāi)腹腔，游離膽總管后縫合關(guān)腹腔。術(shù)后仍在標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物房飼養(yǎng)。術(shù)后4周處死小鼠，并取肝組織用于HE 及Masson染色、免疫組織化學(xué)染色、Western blot及Real-time檢測(cè)。在形態(tài)學(xué)水平上，用HE 及Masson兩種方式驗(yàn)證造模是否成功。

4 小鼠肝臟形態(tài)學(xué)水平檢測(cè)

小鼠肝組織取材后放入10%福爾馬林中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋后制作石蠟切片，后進(jìn)行一系列HE和Masson染色，用于確定肝纖維化造模是否成功，最后于光鏡下觀察其病理變化并照相。

5 免疫組織化學(xué)染色

小鼠肝組織石蠟切片經(jīng)過(guò)脫蠟后，浸泡入蒸餾水，用枸櫞酸鈉緩沖進(jìn)行抗原修復(fù)后，其余步驟遵循福建邁新試劑公司免疫組織化學(xué)染色步驟進(jìn)行。一抗?jié)舛确謩e為：TAOK1（1：100）、p38（1：200）、MEK3（1：200），4℃孵育過(guò)夜；次日滴加生物素化的二抗，期間洗滌液均為PBS，之后每張切片滴加約50ul鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，并用DAB進(jìn)行顯色，鏡下觀察，適時(shí)用自來(lái)水進(jìn)行中止；蘇木素復(fù)染、自來(lái)水沖洗反藍(lán)、酒精脫水、二甲苯透明等后用樹(shù)膠封片，鏡檢、拍照。

6 Western blot檢測(cè)

于造模4周時(shí)取正常組和BDL模型組肝組織50mg，加入約600μl RIPA蛋白裂解液（主要成分：25mmol/L Tris-HCl pH 7.6, 150mmol/L NaCl, 1% NP-40, 1% 脫氧膽酸鈉, 0.1% SDS,1mmol/L PMSF和蛋白酶抑制劑復(fù)合物），充分裂解并用勻漿器勻漿，12000r/min離心后取上清（即為提取的總蛋白）分裝于1.5ml EP管中，后用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取約20μg蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，后以0.3A恒流轉(zhuǎn)印至PVDF膜。第一抗體4°C孵育過(guò)夜，次日，用與HRP偶聯(lián)的第二抗體室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯示條帶，使用生物分子凝膠成像儀曝光、拍照。

7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)（Real-time PCR）

根據(jù)RNA提取試劑盒中的具體步驟提出肝組織中的總RNA，統(tǒng)一濃度后，利用頸環(huán)引物將RNA逆轉(zhuǎn)為與miR-706對(duì)應(yīng)的DNA。Real-time PCR檢測(cè)中體系總體積為20μl，其中含有SYBR Green Super Mix、上下游引物、DEPC水及20ng DNA；擴(kuò)增條件為95℃（5min），然后95℃（20s）、56℃（20s）和72℃（20s），共40個(gè)循環(huán)，所有檢測(cè)過(guò)程均在ABI公司7500機(jī)器中進(jìn)行。將相應(yīng)CT值利用（2-ΔΔCT）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并分析。實(shí)驗(yàn)中涉及到的頸環(huán)引物及microRNA引物見(jiàn)表1。

表1 microRNA引物序列Tab.1 primer sequences of microRNA

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Western blot實(shí)驗(yàn)中，利用Image J測(cè)定條帶光密度值，以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白光密度值/β-actin光密度值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示；RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，利用（2-ΔΔCT）公式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；并利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 膽總管結(jié)扎小鼠模型肝纖維化明顯

圖1 小鼠BDL肝纖維化模型的組織學(xué)（A）與Western blot（B）檢測(cè)鑒定。比例尺，100μm；*，P＜0.01（n＝4）Fig.1 Histology (A) and Western blotting (B) evaluation of BDL-induced liver fibrosis mouse model.Scale bar, 100μm; *, P＜0.01 (n = 4)

對(duì)小鼠進(jìn)行膽總管結(jié)扎手術(shù)后，取材時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，BDL模型組小鼠肝臟表面出現(xiàn)較為明顯的顆粒感；HE及Masson染色結(jié)果顯示（圖1A）：與對(duì)照組相比，BDL模型組組中出現(xiàn)明顯的纖維增生，纖維包繞肝細(xì)胞形成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán)，并伴隨有一定的肝細(xì)胞變性及炎癥反應(yīng)。提取Sham組及BDL模型組肝組織蛋白，Western blot結(jié)果顯示（圖1B），BDL肝纖維化組中α-SMA、Collagen I的表達(dá)含量明顯增加。以上數(shù)據(jù)表明BDL肝纖維化造模成功。

2 肝纖維化小鼠肝組織內(nèi)miR-706表達(dá)量下降

膽總管結(jié)扎4周后取材，RT-PCR結(jié)果顯示，與本課題組前期基因芯片結(jié)果相同[7]，與對(duì)照組相比，miR-706在4周及6周BDL肝纖維化小鼠肝組織內(nèi)的表達(dá)量顯著下降（圖2）。

3 肝纖維化小鼠肝組織內(nèi)TAOK1及其下游MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)增加

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示（圖3）：肝纖維化組中肝組織內(nèi)TAOK1的表達(dá)含量顯著增加，同時(shí)，因TAOK1作為p38/MAPK14轉(zhuǎn)錄激活因子，可以應(yīng)激性活化下游的MAPK信號(hào)通路，p38、MEK表達(dá)量都有所增加。

圖2 肝纖維化4周和6周小鼠肝組織內(nèi)miR-706表達(dá)的Real-time RT-PCR檢測(cè)。*，P＜0.01（n=4）Fig.2 Real-time RT-PCR analysis of miR-706 expression in the fibrotic livers of 4- and 6- weeks old mice.*, P＜0.01 (n=4)

討 論

肝纖維化是一種復(fù)雜的病理生理過(guò)程，在長(zhǎng)期損傷因素的刺激下，肝臟在修復(fù)愈合的過(guò)程中慢慢向纖維化進(jìn)展。目前有大量研究表明，對(duì)于肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的細(xì)胞和分子學(xué)機(jī)制，可能與各種途徑所導(dǎo)致的肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活[12,13]，金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）-基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）平衡失調(diào)所致的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的沉積[14,15]，肝內(nèi)EMT的發(fā)生有關(guān)[16-18]。近幾年來(lái)，隨著各個(gè)領(lǐng)域?qū)iRNA研究越發(fā)增多，也有部分研究表明，miRNA與肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)，例如，現(xiàn)有臨床研究表明，在慢性乙型肝炎患者體內(nèi)血清中miR-125a-5p的表達(dá)水平明顯升高[19]，更有發(fā)現(xiàn)表明乙肝患者血清中miR-29水平可以作為肝纖維化階段的分級(jí)相關(guān)標(biāo)志物[20]。Miyaaaki課題組也發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝患者血清中miR-122的含量可作為肝纖維化的診斷依據(jù)[21]。miRNA對(duì)肝纖維化起到的治療作用，有研究表明，miR-125A-5p、miR-29a等的下調(diào)可以抑制HSC的活化與增殖[22,23]；而過(guò)表達(dá)miR-378a-3p、miR-370可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，有治療肝纖維化的潛力[24,25]。更有研究表明miR-155可以抑制EMT以及ERK信號(hào)通路[26]。在前期工作中，我們通過(guò)基因芯片的篩選及RT-PCR兩種方式發(fā)現(xiàn)，miR-706在CCl4造模的小鼠肝纖維化組織中顯著低表達(dá)，并且為首次報(bào)道[10]。其下游靶基因 TAOK1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過(guò) p38 / Mapk14應(yīng)激激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)控DNA損傷反應(yīng)、細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性、介導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化及細(xì)胞凋亡[27]?，F(xiàn)已有研究表明，其下游介導(dǎo)的p38/Mapk14通路的激活能夠引起HSC的大量增殖，從而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展[28]。本次研究發(fā)現(xiàn)，在BDL肝纖維化模型中，miR-706的表達(dá)含量顯著下降，其可通過(guò)激活下游靶基因TAOK1介導(dǎo)的p38/MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。同時(shí)，本次研究也為miR-706在肝纖維化的中的治療提供理論依據(jù)。

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