新生期缺氧缺血腦白質(zhì)損傷大鼠神經(jīng)元樹突和突觸損傷

林凌，張更，林巧梅，林清

（福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)系，神經(jīng)生物學(xué)研究中心，福州 350122)

隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的發(fā)展，早產(chǎn)兒和極低體重兒的存活率越來越高，臨床上腦白質(zhì)損傷的發(fā)病率亦呈增高的趨勢(shì)。腦白質(zhì)損傷（white matter injury, WMI）患兒常有腦癱、智力低下、視力障礙和聽覺異常等多種神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，成為亟待解決的臨床問題。眾多研究表明，缺氧缺血（hypoxiaischemia, HI）是引起腦白質(zhì)損傷的重要因素[1,2]。我們的前期研究結(jié)果亦顯示，結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈及缺氧可致新生大鼠腦白質(zhì)發(fā)生損傷，并且缺氧缺血后4周其行為學(xué)和認(rèn)知能力下降[3]，但腦白質(zhì)損傷大鼠行為學(xué)和學(xué)習(xí)記憶能力下降的具體機(jī)制仍未完全闡明。早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的靶細(xì)胞是少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，主要病理改變?yōu)槟X白質(zhì)病變，但越來越多的研究認(rèn)為大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降與神經(jīng)元發(fā)育成熟障礙有關(guān)[4,5]，并且皮層和海馬等腦區(qū)是參與學(xué)習(xí)記憶的重要結(jié)構(gòu)[6]。目前對(duì)缺氧缺血腦白質(zhì)損傷后大鼠皮層和海馬神經(jīng)元變化的報(bào)道較少，為進(jìn)一步明確早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷后智力障礙與神經(jīng)元異常的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)擬探討缺氧缺血后4周大鼠皮層和海馬神經(jīng)元數(shù)量及樹突結(jié)構(gòu)變化情況。

神經(jīng)元樹突是神經(jīng)元發(fā)揮功能的關(guān)鍵部位，神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)的改變影響神經(jīng)環(huán)路內(nèi)信息傳遞，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶能力的下降。樹突棘是神經(jīng)元樹突上的棘狀突起，是學(xué)習(xí)和記憶活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)于神經(jīng)元信息的獲得和傳遞至關(guān)重要，樹突棘的結(jié)構(gòu)異常可改變突觸的功能，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知缺陷[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立缺氧缺血腦白質(zhì)損傷模型，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元NeuN和MAP-2的表達(dá)情況，應(yīng)用高爾基染色法觀察神經(jīng)元樹突及樹突棘結(jié)構(gòu)變化，并應(yīng)用Western blot法測(cè)定Syn表達(dá)量的改變，明確腦白質(zhì)損傷中神經(jīng)元數(shù)量及樹突結(jié)構(gòu)的變化情況，為深入研究早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷致學(xué)習(xí)記憶能力下降的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

新生3日齡SD大鼠24只，雌雄不拘，體重8.00～11.00g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK(閩)2012-0001）。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和WMI組。兔抗大鼠MBP抗體、兔抗大鼠NeuN抗體、兔抗大鼠Syn抗體（美國Abcam公司）；小鼠抗大鼠MAP-2抗體（美國ABclonal公司）；Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor555標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國Invitrogen公司）；DAPI（瑞士Roche公司）；小鼠抗大鼠GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG及免疫印跡相關(guān)試劑（碧云天生物技術(shù)研究所）。

2 缺血缺氧腦白質(zhì)損傷模型的建立

參照本實(shí)驗(yàn)室原有方法[3]稍加改進(jìn)。無水乙醚麻醉大鼠，消毒，作頸腹側(cè)正中切口，長約0.5cm；分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后縫合皮膚；術(shù)后于37℃水浴箱內(nèi)放置10min，待體溫和活動(dòng)恢復(fù)正常，返籠飼養(yǎng)2h后，將大鼠置于XF-XC06-I型低壓氧倉全自動(dòng)控制儀（南京柏曼信息科技服務(wù)中心）以8%的氧氣缺氧30min。對(duì)照組大鼠僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不予結(jié)扎及缺氧。

3 標(biāo)本制備

缺氧缺血后4周分別取對(duì)照組和WMI組大鼠各6只。動(dòng)物用10%水合氯醛（3ml/kg）麻醉，經(jīng)左心室插管灌注生理鹽水，待流出清亮液體后繼續(xù)以4%多聚甲醛灌注，待大鼠四肢完全僵直后斷頭取腦，冰凍切片行免疫熒光染色。

4 免疫熒光染色

腦組織冰凍切片（片厚25μm）后行漂片染色。以免疫熒光顯色封閉液室溫封閉2h；傾去封閉液，分別滴加兔抗大鼠MBP抗體（1∶200）、兔抗大鼠NeuN抗體（1∶200）和兔抗大鼠Syn抗體（1∶200）、小鼠抗大鼠MAP-2抗體（1∶200），4℃孵育過夜；用0.01mol/LPBS清洗后，滴加AlexaFluor555標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶200）、AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG（1∶200），37℃ 孵育 2h；DAPI（1mg/L）染核5min，抗熒光淬滅封片劑封片。激光掃描共聚焦顯微鏡（德國徠卡，Leica sp8）下觀察，綠色激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為500-530nm；紅色激發(fā)波長為552nm，發(fā)射波長為570-600nm；藍(lán)色激發(fā)波長為405nm，發(fā)射波長為420-450nm。陰性對(duì)照組以PBS代替一抗進(jìn)行染色。

用激光掃描共聚焦顯微鏡圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)NeuN陽性細(xì)胞數(shù)。每只大鼠取3張切片，每張切片于皮層和海馬分別選擇3個(gè)高倍視野（40×）進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量計(jì)數(shù)。

5 高爾基染色

用10g/L重鉻酸鉀、10g/L氯化汞、8g/L鉻酸鉀配制高爾基液，避光于室溫儲(chǔ)存5天備用。取HI后4周對(duì)照組與WMI組大鼠各3只，用10%水合氯醛（3ml/kg）麻醉后，0.01mol/L PBS灌注至清亮后用續(xù)以0.5%多聚甲醛灌流，斷頭取腦。腦組織置于高爾基液中，37℃溫箱中避光3d。30%蔗糖溶液脫水，4%瓊脂包埋，振動(dòng)切片(200μm)，室溫晾干，過夜后染色，中性樹脂封片，顯微鏡下（德國蔡司，Primo Star）觀察。

6 Western blot分析

缺氧缺血后4周分別取對(duì)照組和WMI組大鼠各3只，共6只。以細(xì)胞裂解液裂解大鼠腦組織（包含皮質(zhì)和海馬）后用超聲細(xì)胞破碎儀勻漿，BCA法測(cè)定蛋白濃度，定量后取每孔上樣量50μg蛋白，SDSPAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)于PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加入兔抗大鼠Syn抗體（1∶1000，4℃孵育過夜）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1000，室溫孵育2h），洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影和定影，生物分子成像儀（日本，LAS 4000 mini）成像。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。用ImageJ2.1圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析，以各組目的蛋白與內(nèi)參蛋白光密度值計(jì)算相對(duì)比值。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用SPSS l9.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 缺氧缺血后腦白質(zhì)損傷

缺氧缺血腦白質(zhì)損傷主要病理表現(xiàn)為髓鞘合成障礙，腦白質(zhì)變疏松甚至軟化。MBP作為少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物之一，是髓鞘重要成分，可作為髓鞘損傷的標(biāo)志。缺氧缺血后4周，對(duì)照組腦白質(zhì)MBP免疫反應(yīng)陽性物排列整齊、致密、突起較長（圖1A）；而WMI組MBP免疫反應(yīng)陽性物較相應(yīng)對(duì)照組減少，排列較紊亂、稀疏、突起變短（圖1B），提示腦白質(zhì)損傷。

圖1 免疫熒光檢測(cè)缺氧缺血對(duì)腦白質(zhì)MBP水平的影響。A, 對(duì)照組；B, WMI組；cc，胼胝體；比例尺，50μmFig.1 The effect of hypoxia-ischemia on MBP level in brain white matter evaluated by immunofluorescence staining.A, control group; B, WMI group;cc, corpus callosum; scale bar, 50μm

2 缺氧缺血后神經(jīng)元數(shù)量無變化

缺氧缺血后4周，免疫熒光染色結(jié)果顯示，NeuN表達(dá)于神經(jīng)元胞體；細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示，對(duì)照組和WMI組皮層和海馬神經(jīng)元數(shù)量均無明顯改變（圖2）。

3 缺氧缺血后神經(jīng)元樹突損傷

免疫熒光染色顯示，MAP-2表達(dá)主要位于皮層和海馬神經(jīng)元的樹突和胞體，對(duì)照組突起細(xì)直而平滑，染色均一（圖3左列）；WMI組突起則彎曲、斷續(xù)（圖3右列）。高爾基染色標(biāo)記神經(jīng)元胞體和突起，高倍鏡下可見神經(jīng)元樹突棘；與對(duì)照組相比，WMI組樹突棘數(shù)量減少（圖4）。

4 缺氧缺血后突觸素表達(dá)減少

缺氧缺血后4周，免疫熒光檢測(cè)顯示，Syn表達(dá)于皮層和海馬細(xì)胞胞質(zhì)，成顆粒狀分布。免疫熒光與Western blot分析均顯示，WMI組Syn表達(dá)量顯著減少（圖5）。

討 論

本研究通過永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈聯(lián)合缺氧法致使新生大鼠發(fā)生缺氧缺血腦白質(zhì)損傷，應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)染色法檢測(cè)腦白質(zhì)MBP和神經(jīng)元NeuN、MAP-2和Syn的表達(dá)，高爾基染色觀察神經(jīng)元樹突棘變化，采用Western blot法檢測(cè)Syn在腦內(nèi)的變化。我們發(fā)現(xiàn)，新生期大鼠發(fā)生缺氧缺血腦白質(zhì)損傷后4周神經(jīng)元數(shù)量未見明顯缺失，但其樹突損傷，樹突棘數(shù)量減少，突觸減少，從而導(dǎo)致神經(jīng)元之間聯(lián)系減少。

圖2 缺氧缺血對(duì)神經(jīng)元數(shù)量的影響。A, 神經(jīng)元數(shù)量的NeuN免疫熒光染色檢測(cè)（DAPI復(fù)染）.CX，大腦皮質(zhì)；HP，海馬；比例尺，50μm；B，大腦皮質(zhì)（上）和海馬（下）神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析；P＞0.05Fig.2 Effect of hypoxia-ischemia on the number of neurons.A, immunostaining of NeuN (red) positive neurons in cerebral cortex (CX, upper) and hippocampus (HP, lower); DAPI counter-stained nucleus (blue); scale bar, 50μm; B, statistical analysis of NeuN positive neuron counts in CX and HP; P＞0.05

缺氧缺血腦白質(zhì)損傷為早產(chǎn)兒腦損傷的常見類型，主要病理表現(xiàn)為髓鞘合成障礙。本研究結(jié)果顯示，缺氧缺血后WMI組大鼠MBP表達(dá)量下降，纖維排列紊亂、稀疏，提示缺氧缺血后出現(xiàn)腦白質(zhì)病變。對(duì)缺氧缺血腦白質(zhì)損傷大鼠進(jìn)行神經(jīng)元NeuN免疫熒光染色顯示，WMI組皮層和海馬神經(jīng)元數(shù)量未發(fā)生顯著改變。Misumi等[8]的研究結(jié)果表明，缺氧缺血早期，大量晚期少突膠質(zhì)前體細(xì)胞發(fā)生凋亡，但未見明顯神經(jīng)元凋亡。Pierson[9]等對(duì)腦白質(zhì)損傷患兒研究中亦發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)元數(shù)量沒有減少。缺氧缺血腦白質(zhì)損傷時(shí)雖未觀察到神經(jīng)元數(shù)量發(fā)生明顯改變，那么神經(jīng)元結(jié)構(gòu)是否發(fā)生異常？由于樹突是神經(jīng)元接收、加工和整合輸入信息的基本部位，我們重點(diǎn)觀察了樹突結(jié)構(gòu)的變化。

MAP-2是一種微管相關(guān)蛋白，可作為神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白，在大鼠神經(jīng)元中表達(dá)豐富，主要存在于神經(jīng)元的胞體和樹突中。MAP-2是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要環(huán)節(jié)，參與神經(jīng)元的生長和損傷后修復(fù)過程，是神經(jīng)細(xì)胞受損及再生指標(biāo)之一[10]。MAP-2免疫熒光染色結(jié)果顯示，對(duì)照組突起細(xì)直而平滑、染色均一，WMI組突起則彎曲、斷續(xù)，提示神經(jīng)元樹突損傷。Dean[11]等研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血可致皮層錐體神經(jīng)元樹突減少，并認(rèn)為這可能與大腦損傷后神經(jīng)元成熟過程受影響有關(guān)。樹突棘是樹突分支上常見的棘狀興奮性突觸，在動(dòng)物的生長發(fā)育過程中，學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)，神經(jīng)元樹突長度和樹突橫截面均顯著增大；學(xué)習(xí)能力下降時(shí)，又轉(zhuǎn)而降低[12]。而高爾基染色法是公認(rèn)的最傳統(tǒng)和有效的神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)研究的方法[13]。本研究應(yīng)用高爾基染色法觀察缺氧缺血對(duì)神經(jīng)元樹突棘的影響，我們發(fā)現(xiàn)WMI組樹突棘數(shù)量減少。陳元壽[14]等研究亦發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致樹突形態(tài)改變和樹突棘丟失，尤其是海馬內(nèi)樹突棘脫落及消失，可能是腦缺血后患者認(rèn)知功能障礙的主要原因。由此說明神經(jīng)元樹突棘缺失可能影響學(xué)習(xí)記憶能力。

突觸是實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元信息傳遞的重要結(jié)構(gòu)，與認(rèn)知損害聯(lián)系密切[15]。Syn是突觸囊泡膜上的一種鈣結(jié)合蛋白，與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。Syn不僅參與Ca2+依賴性的神經(jīng)遞質(zhì)釋放，還參與神經(jīng)元間信息傳遞，既是突觸發(fā)生的標(biāo)志，又是突觸傳遞效能水平的反映[16]。此外，Syn作為突觸重塑的特異性分子標(biāo)志物，與突觸的形成及維持突觸的穩(wěn)定有關(guān)[17]，可準(zhǔn)確反映突觸的分布和密度。我們的免疫熒光與Western blot結(jié)果均顯示，WMI組Syn蛋白表達(dá)量減少，提示突觸減少。Balakrishnan等[18]研究認(rèn)為，炎癥可致早產(chǎn)兒神經(jīng)元發(fā)育障礙，造成神經(jīng)元樹突和樹突棘數(shù)量減少，Syn表達(dá)量下降，突觸間傳遞減少。

圖3 MAP-2免疫熒光檢測(cè)缺氧缺血對(duì)腦組織樹突結(jié)構(gòu)的影響。CX，皮層；HP，海馬；對(duì)照組中箭頭示突起細(xì)直而平滑；WMI組中箭頭示突起彎曲、斷續(xù)；比例尺，50μmFig.3 MAP-2 immunostaining to visualize dendritic morphology affected by hypoxia-ischemia.CX, cerebral cortex; HP, hippocampus; arrows point to dendrites that are straight and continuous in control group, while bent and fragmented in WMI group; scale bar, 50μm

圖4 高爾基染色檢測(cè)缺氧缺血后神經(jīng)元樹突棘變化。箭頭示神經(jīng)元樹突棘；比例尺，10μmFig.4 Golgi-Cox staining to investigate the effect of hypoxia-ischemia on dendritic spines.Arrow indicates dendritic spines; scale bar, 10μm

0～2 歲是兒童神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要時(shí)期，WMI患兒認(rèn)知和行為學(xué)障礙通常在幼兒期才明顯固定化，而出生后4周大鼠在神經(jīng)發(fā)育上相當(dāng)于2周歲兒童[19]。我們的研究結(jié)果總體顯示，新生大鼠缺氧缺血后4周神經(jīng)元的數(shù)量未發(fā)生明顯改變，但其樹突損傷，樹突棘數(shù)量減少，且突觸素減少，說明此時(shí)神經(jīng)元間傳遞減少，可因此導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。早產(chǎn)兒腦神經(jīng)元尚未發(fā)育完全，缺氧缺血影響神經(jīng)元進(jìn)一步發(fā)育成熟[20]，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Werhahn等[21]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血損傷后突觸可發(fā)生可塑性變化，在很大程度上，突觸的可塑性反映了神經(jīng)系統(tǒng)回路的可塑性。研究認(rèn)為大鼠神經(jīng)元發(fā)育高峰期為生后7 天之內(nèi)，一般認(rèn)為第5天是神經(jīng)元發(fā)育的高峰期并開始形成功能性突觸連接[22]，有效調(diào)節(jié)這種可塑性變化將有助于腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)，神經(jīng)元樹突棘和突觸的可塑性研究有助于為治療新生兒缺氧缺血腦白質(zhì)損傷提供新思路。

圖5 缺氧缺血對(duì)腦組織Syn表達(dá)的影響。A, 免疫熒光檢測(cè)；CX，皮層；HP，海馬；比例尺，10μm；B1, Western blot檢測(cè)；B2， Western blot檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與對(duì)照組相比，0.01＜P＜0.05Fig.5 Effect of hypoxia-ischemia on Syn expression.A, immunostaining of Syn (Red).Nucleus counter-stain (Blue); CX, cerebral cortex; HP, hippocampus; scale bar, 10μm; B1, representative western blot results; B2, statistical analysis of Western blot.*, compared with control, 0.01＜P＜ 0.05

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