樣品不同稀釋倍數(shù)的菌落總數(shù)檢測(cè)分析

高 杰

(國家城市供水水質(zhì)監(jiān)測(cè)網(wǎng)武漢監(jiān)測(cè)站，湖北 武漢 430000)

飲用水國標(biāo)GB/T 5750.12-2006定義菌落總數(shù)是指水樣在營養(yǎng)瓊脂上有氧條件下37℃培養(yǎng)48 h后，所得1 mL水樣所含菌落的總數(shù)[2]。水中的細(xì)菌學(xué)檢查是評(píng)判水質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，作為日常檢測(cè)七項(xiàng)指標(biāo)(色度、濁度、嗅和味、肉眼可見物、菌落總數(shù)、總大腸菌群、pH值)之一的菌落總數(shù)，主要反映了水體的受污染程度以及評(píng)價(jià)水處理工藝是否達(dá)標(biāo)的主要因素。

在實(shí)際工作中檢測(cè)人員經(jīng)常會(huì)參加微生物盲樣考核，能夠快速提升自身的技術(shù)水平[3]，可以對(duì)欠缺的理論知識(shí)進(jìn)行查漏補(bǔ)缺，充分保證測(cè)定數(shù)據(jù)達(dá)到確定的檢驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4]。進(jìn)行菌落總數(shù)考核時(shí)，檢測(cè)人員要面臨如何確定稀釋倍數(shù)這一主要問題。本文通過對(duì)已知菌落總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行不同梯度的稀釋，分析不同稀釋倍數(shù)樣品之間的數(shù)據(jù)差異，對(duì)今后的微生物考核能夠提供一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

營養(yǎng)瓊脂，標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度范圍146±19cfu/mL)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，無菌移液管，無菌取樣瓶，9cm玻璃平皿。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品前處理

將標(biāo)準(zhǔn)樣品管從冰箱中取出，置于室溫平衡10～15min。將100 mL無菌緩沖液(PBS)倒入100mL無菌取樣瓶中定量。把管中有顏色的圓形膠盤無菌操作轉(zhuǎn)移至100 mL無菌PBS中(必要時(shí)可使用無菌鑷子，一定要在鑷子冷卻后夾取膠盤)。充分振蕩后靜置10min，直到圓形膠盤完全溶解，得到待檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)原液(使用前要充分搖勻)。

1.3.2 平皿計(jì)數(shù)法

為保證數(shù)據(jù)的充分可靠性，設(shè)計(jì)了4個(gè)稀釋梯度，分別是1倍、2倍、5倍、10倍的稀釋液：

1)1倍稀釋液是標(biāo)準(zhǔn)原液；無菌操作方法吸取20 mL充分混勻的標(biāo)準(zhǔn)原液，注入盛有20 mL滅菌水的無菌瓶中，混勻成2×稀釋液；無菌操作方法吸取20 mL充分混勻的標(biāo)準(zhǔn)原液，注入盛有80 mL滅菌水的無菌瓶中，混勻成5×稀釋液；無菌操作方法吸取10 mL充分混勻的標(biāo)準(zhǔn)原液，注入盛有90 mL滅菌水的無菌瓶中，混勻成10×稀釋液；

2)以無菌操作方法分別吸取1mL不同稀釋倍數(shù)的樣品，吸取樣品前要充分混勻，注入到玻璃平皿中，傾注約15mL已融化并冷卻到45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，立即旋搖平皿，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻；

3)待培養(yǎng)基冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置于(36±1)℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，分別進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 十組平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

將每一個(gè)稀釋樣品做10組平行樣，分析表1和圖1的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，1×標(biāo)準(zhǔn)原液和2×稀釋樣品的菌落總數(shù)分布相對(duì)集中，平均值也都在合理范圍。隨著稀釋倍數(shù)越來越高，樣品的菌落總數(shù)分布越來越離散，其中5×和10×的稀釋樣品平均值不在允許濃度范圍內(nèi)。當(dāng)樣品被稀釋的倍數(shù)變大時(shí)，那么每一次取樣的均勻性就會(huì)越來越低，導(dǎo)致偏差較大。

表1 各稀釋樣品的菌落總數(shù)

圖1 各稀釋樣品菌落總數(shù)散點(diǎn)圖

2.2 二十組平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

將每一個(gè)稀釋樣品再做20組平行樣，分析表2和圖2的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，1×標(biāo)準(zhǔn)原液和2×稀釋樣品的菌落總數(shù)分布情況與圖1類似，2×稀釋樣品的平均值更加接近中位值146cuf/mL。通過增加樣品量，5×稀釋樣品的菌落總數(shù)平均值落在合理范圍內(nèi)。但是10×稀釋樣品的菌落總數(shù)依然不在有效范圍內(nèi)，這是因?yàn)樵摌?biāo)準(zhǔn)樣品菌落總數(shù)的確定范圍是(146±19)cfu/mL，如果稀釋到10倍，誤差就會(huì)變大，數(shù)據(jù)間的差值也會(huì)很不均衡。通過增加平行樣數(shù)量，可以使結(jié)果更加精準(zhǔn)，但是如果稀釋倍數(shù)過高，那么就需要更多的樣本量，才可能使結(jié)果準(zhǔn)確，不過這會(huì)導(dǎo)致實(shí)際實(shí)驗(yàn)中效率下降，精力耗費(fèi)過大。

表2 各稀釋樣品的菌落總數(shù)

圖2 各稀釋樣品菌落總數(shù)散點(diǎn)圖

2.3 討論

在實(shí)際考核中，一般情況下質(zhì)控考核作業(yè)指導(dǎo)書會(huì)標(biāo)明菌落總數(shù)盲樣的濃度范圍，那么在確定稀釋倍數(shù)時(shí)，檢測(cè)人員應(yīng)該盡可能的把稀釋后的樣品菌落總數(shù)落在300cfu/mL范圍內(nèi)，這樣可以使菌落在9 cm玻璃平皿上最大化的均勻分布，還能夠保證最有效的稀釋倍數(shù)；如果質(zhì)控考核作業(yè)指導(dǎo)書沒有給出菌落總數(shù)濃度范圍，那么檢測(cè)人員就要根據(jù)實(shí)際情況制定一系列的稀釋梯度，而且對(duì)于稀釋度高的樣品要做至少20組的平行實(shí)驗(yàn)，以此來保證數(shù)據(jù)的可靠性。不管是否提供濃度范圍，實(shí)驗(yàn)中都要保證每一個(gè)稀釋度都有比較充足的樣本量，低倍稀釋樣品可以有所縮減，以此來提高實(shí)驗(yàn)效率和準(zhǔn)確度。

[1]王虹玲. 微生物質(zhì)控考核盲樣未知菌檢測(cè)方法探討[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2000(5): 603.

[2]劉玉紅,景二丹,胡興利, 等. 酶底物法與平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定水中菌落總數(shù)的比較[J]. 中國給水排水, 2017(2): 111-114.

[3]楊獻(xiàn)青,何惠娟. 微生物質(zhì)控盲樣菌株鑒定的檢驗(yàn)思路與質(zhì)量保證[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2010(3): 663-664.

[4]王云國,李懷燕. 食品微生物檢驗(yàn)內(nèi)容及檢測(cè)技術(shù)[J]. 糧油食品科技, 2010(3): 40-43.