神經(jīng)節(jié)苷脂GD3和CD3+T淋巴細(xì)胞在胃癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

宋寵，勞力軍

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121000）

胃癌是我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)[1]。目前對(duì)于胃癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但既往研究[2]表明在胃癌的進(jìn)展過程中，腫瘤細(xì)胞通過促進(jìn)免疫細(xì)胞凋亡或降低免疫細(xì)胞功能，抑制機(jī)體對(duì)腫瘤的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生免疫逃逸。T淋巴細(xì)胞作為一種重要的免疫活性細(xì)胞，直接參與細(xì)胞免疫并調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答。有研究[3]顯示，在早期胃癌患者的外周血中增殖性T淋巴細(xì)胞數(shù)量高于進(jìn)展期胃癌，表明胃癌的進(jìn)展與T淋巴細(xì)胞減少有關(guān)。神經(jīng)節(jié)苷脂是細(xì)胞膜的組成部分，可以從多種腫瘤細(xì)胞表面脫落。隨著腫瘤惡性程度的增高，外周循環(huán)血中的神經(jīng)節(jié)苷脂含量增加明顯，提示神經(jīng)節(jié)苷脂可能與腫瘤的發(fā)展關(guān)系密切[4]。實(shí)驗(yàn)研究[5-7]顯示，腫瘤神經(jīng)節(jié)苷脂能抑制T淋巴細(xì)胞功能，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)人胃癌及癌旁組織中神經(jīng)節(jié)苷脂GD3和CD3+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)，分析兩者間的相關(guān)性并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2010年6月至2014年6月期間于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科經(jīng)術(shù)前胃鏡下取病變組織活檢、術(shù)中病變組織病理檢測(cè)被證實(shí)為胃癌的病例38例，其中男27例，女11例，年齡28～84歲，中位年齡59歲。38例患者術(shù)前均未進(jìn)行化療、放射治療、免疫治療等，臨床信息完整。38例患者均經(jīng)我院病理科2位資深醫(yī)生雙盲閱片診斷為胃潰瘍型中—低分化腺癌。將胃癌腫瘤組織設(shè)為A組，將同一患者癌旁胃壁組織 （距腫瘤邊緣>5 cm，且病理證實(shí)無腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)） 設(shè)為B組。全部病例排除胃部消化性潰瘍病變及其他消化系統(tǒng)疾病。

1.2 主要試劑

鼠抗人GD3單克隆抗體 （ab11779，美國(guó)Abcam公司） ，鼠抗人CD3單克隆抗體 （AB28005，美國(guó)Absci公司） ，山羊抗鼠二抗 （ab6785，美國(guó)Abcam公司） ，濃縮型DAB試劑盒 （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 研究方法

手術(shù)中收集新鮮腫瘤標(biāo)本，標(biāo)本離體后切取腫瘤組織、癌旁胃壁組織 （距腫瘤邊緣>5 cm，且病理證實(shí)無腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)） ，將收集的組織用中性多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。鼠抗人GD3抗體和鼠抗人CD3抗體分別按1︰200和1︰100稀釋。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 HE染色：由2位資深病理科醫(yī)生雙盲閱片判定所取組織是否為胃癌組織和癌旁正常胃壁組織。

1.4.2 免疫組化染色：GD3標(biāo)記細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈黃色為陽性細(xì)胞，呈圓形或者不規(guī)則形態(tài)；CD3標(biāo)記細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈黃色為陽性細(xì)胞，呈圓形或者不規(guī)則形態(tài)。A組低倍鏡視野下選取癌巢密集區(qū)，取5個(gè)高倍鏡 （×400） 視野計(jì)數(shù)。B組低倍鏡視野下選取胃壁腺葉組織密集區(qū)，取5個(gè)高倍鏡 （×400） 視野計(jì)數(shù)。按染色細(xì)胞所占比例與染色強(qiáng)度判定結(jié)果，依據(jù)染色細(xì)胞所占比例，<5%計(jì)0分，5%～<25%計(jì)1分，25%～<50%計(jì)2分，≥50%計(jì)3分；依據(jù)染色強(qiáng)度，細(xì)胞無染色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，深棕色計(jì)3分。每張切片計(jì)分為染色細(xì)胞所占比例與染色強(qiáng)度之積，所得分?jǐn)?shù)≥1為陽性，<1為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。同一檢測(cè)指標(biāo)不同組間差異用χ2檢驗(yàn)，神經(jīng)節(jié)苷脂GD3與CD3+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)相關(guān)性用Spearman秩相關(guān)性分析。P> 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

經(jīng)由2位資深病理科醫(yī)生雙盲閱片判定所取組織為胃癌組織和癌旁正常胃壁組織 （距腫瘤邊緣>5 cm） 。見圖1。

圖1 HE染色結(jié)果 ×100Fig.1 HE staining results ×100

2.2 免疫組化染色

神經(jīng)節(jié)苷脂GD3在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)均定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。胃癌組織和癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為81.58% （31/38） 和28.95%（11/38） ，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=21.289，P< 0.01） ，見圖2A、2B。

CD3+T淋巴細(xì)胞在胃癌組織和癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為23.68% （9/38） 和78.95% （30/38） ，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=23.227，P< 0.01） ，見圖2C、2D。

2.3 神經(jīng)節(jié)苷脂GD3與CD3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性

分析胃癌組織及癌旁組織中神經(jīng)節(jié)苷脂GD3與CD3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果提示2種組織中兩者的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān) （胃癌組織：r= -0.744，P< 0.01；癌旁組織：r= -0.678；P< 0.01） 。見表1。

表1 胃癌組織和癌旁組織中神經(jīng)節(jié)苷脂GD3與CD3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性Tab.1 Correlation between ganglioside GD3 and CD3+ T lymphocyte expression in gastric cancer tissues and adjacent tissues

3 討論

神經(jīng)節(jié)苷脂是細(xì)胞膜的組成部分，是一種含有一個(gè)或多個(gè)唾液酸殘基的鞘糖脂，參與細(xì)胞黏附、增殖、識(shí)別以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)[8]。近年來，研究[9]表明神經(jīng)節(jié)苷脂可以從多種腫瘤細(xì)胞表面脫落，故而在腫瘤組織中表達(dá)明顯增高，同時(shí)神經(jīng)節(jié)苷脂在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過程中具有重要作用。

YEH等[10]發(fā)現(xiàn)GD3和GD3合成酶在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中高度表達(dá)，可與CD133結(jié)合，提示其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤致瘤性中起關(guān)鍵作用。惡性腫瘤的遷移和增殖取決于由腫瘤衍生的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）觸發(fā)的血管生成。TIPER等[11]研究表明腫瘤細(xì)胞脫落神經(jīng)節(jié)苷脂可以引發(fā)強(qiáng)烈的VEGF受體二聚化和自磷酸化，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成信號(hào)傳導(dǎo)的閾值，激活下游信號(hào)通路，有利于腫瘤血管生成。此后，LIU等[12]通過構(gòu)建基因敲除腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)基因敲除細(xì)胞幾乎形成無血管腫瘤；添加純化腫瘤神經(jīng)節(jié)苷脂之后，基因敲除細(xì)胞接種物部分恢復(fù)了血管生成和腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)一步證實(shí)腫瘤神經(jīng)節(jié)苷脂可以促進(jìn)腫瘤血管生成。同樣，CHUNG等[13]發(fā)現(xiàn)腫瘤脫落神經(jīng)節(jié)苷脂在微環(huán)境中使巨噬細(xì)胞活化并分泌MCP-1以激活內(nèi)皮細(xì)胞，從而加速腫瘤微環(huán)境中的血管生成，以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。王天然等[4]通過對(duì)神經(jīng)節(jié)苷脂含量測(cè)定分析表明，腸癌患者血清中神經(jīng)節(jié)苷脂顯著增加，其診斷價(jià)值優(yōu)于癌胚抗原。易珊等[14]檢測(cè)肺癌、乳腺癌、胃癌和腸癌患者的唾液酸含量發(fā)現(xiàn)，4種癌組織中GD3均有較高的陽性表達(dá)率，可能成為這4種癌癥臨床檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，GD3在胃癌組織中的陽性表達(dá)率顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在腫瘤的發(fā)展中，腫瘤細(xì)胞可以通過多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊，達(dá)到免疫逃逸，從而在體內(nèi)生存和增殖[15]。在腫瘤免疫逃逸的眾多機(jī)制中，腫瘤組織誘導(dǎo)的免疫抑制作用被廣泛接受。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)苷脂抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答的多個(gè)步驟，包括抗原呈遞、T細(xì)胞的增殖和功能。

本研究通過檢測(cè)并分析人胃癌組織及癌旁組織中神經(jīng)節(jié)苷脂GD3與CD3+T淋巴細(xì)胞的含量，發(fā)現(xiàn)這2種組織中二者的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。有研究[16]顯示，腫瘤神經(jīng)節(jié)苷脂通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子kB蛋白活化，干擾抗原呈遞細(xì)胞功能，抵抗腫瘤免疫響應(yīng)。腫瘤神經(jīng)節(jié)苷脂可促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性，與腫瘤壞死因子α 協(xié)同誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[17]。同時(shí)，神經(jīng)母細(xì)胞瘤衍生神經(jīng)節(jié)苷脂能與腫瘤壞死因子受體相互作用，激活Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[7]。腫瘤神經(jīng)節(jié)苷脂能夠增加骨髓來源抑制細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)其功能[18]，包括直接抑制抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答，募集調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和抑制效應(yīng)T細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[19-23]。同時(shí)，腫瘤衍生的神經(jīng)節(jié)苷脂通過阻礙T細(xì)胞受體誘導(dǎo)的溶解性顆粒釋放來抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的溶解功能[24]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的表達(dá)水平高于癌旁組織，胃癌組織以及癌旁組織中神經(jīng)節(jié)苷脂GD3與CD3+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。神經(jīng)節(jié)苷脂能夠促進(jìn)腫瘤血管生成、抑制免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

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