基于氣相色譜-質(zhì)譜法的動物類中藥材中1-甲基海因分布研究

袁慧雅，高利娜，劉國杰，徐恩宇，劉俊亭

（中國醫(yī)科大學(xué) 1. 法醫(yī)學(xué)院毒物分析教研室；2. 公共基礎(chǔ)學(xué)院化學(xué)教研室，沈陽 110122）

1-甲基海因 （1-methylhydantoin，1-MH） 是五元含氮雜環(huán)內(nèi)源性小分子化合物，化學(xué)名1-甲基乙內(nèi)酰脲。 《中國藥典》 2015年版一部蛤蟆油項下將其作為鑒別指標(biāo)[1]。研究[2-7]表明1-MH作為乙內(nèi)酰脲類衍生物具有抗炎、消除活氧自由基、止咳平喘等藥理活性。有報道[8-9]青環(huán)海蛇、蟾蜍油和青蛙油中也檢測出1-MH，除蛤蟆油外，林蛙的其他部位也含有1-MH[10]。目前文獻[11-12]報道多為高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 檢測1-MH，為進一步研究具有相似功效動物類中藥材與1-MH的關(guān)系以及1-MH的生成機制，本研究選取8種不同種屬的動物類中藥材，在建立氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)合測定的基礎(chǔ)上研究1-MH的分布狀況。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7890B-5977A氣質(zhì)聯(lián)用儀 （美國Aglient公司） ；BT25S分析天平 （德國賽多利斯公司） ；S25渦旋振蕩器 （德國IKA公司） ；TG16K-Ⅱ高速離心機 （長沙東旺實驗儀器有限公司） 。1-MH （批號20151011） 購自上海一研生物科技有限公司，純度>99.5%；普羅地芬 （內(nèi)標(biāo)，SKF-525A，批號1002181548） 購自美國Sigma公司，純度>98.0%，其他試劑均為色譜純。3批次的蛤蚧、蛤蟆油、烏蛇、海蛇、地龍、全蝎、阿膠、紫河車藥材均購自北京同仁堂藥店，產(chǎn)地為安徽毫州，經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)劉俊亭教授鑒定為正品。

1.2 溶液制備

（1） 對照品溶液：精密稱取 1-MH 對照品適量，加甲醇溶液溶解并制成1.0 mg/mL 溶液。 （2） 內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取內(nèi)標(biāo)物SKF-525A對照品適量，加甲醇溶液溶解并制成100.0 ng/μ L溶液。 （3） 供試品溶液：解剖蛤蚧。分別取其頭部、脊椎骨、骨骼肌、四肢、皮膚、尾部適量稱重，粉碎至粉末狀，各取樣0.4 g置于具塞試管中，分別加入內(nèi)標(biāo)SKF-525A溶液5 μ L，加入0.01 mol/L鹽酸2 mL，超聲提取10 min，用2 mL乙酸乙酯震蕩提取3 min，3500 r/min離心10 min。吸取有機層，用氮氣吹干儀吹至100 μ L，用微量進樣器吸取1 μ L進GC-MS分析。烏蛇、海蛇、地龍、全蝎、阿膠、紫河車以及蛤蟆油樣品均按上述步驟處理。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

（1） 氣相色譜條件：采用HP-5ms （30 m×0.25 mm，0.25 μ m） 彈性石英毛細(xì)管柱。采用程序升溫：初始柱溫為60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升溫至260℃，保持15 min，總計運行26 min。進樣口溫度為265℃，不分流進樣1 μ L。載氣為高純氦氣 （99.9%） ，流速為1.0 mL/min。 （2） 質(zhì)譜條件：采用電子離子轟擊源 （EI源，70 eV） ，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，SIM掃描方式，溶劑延遲3 min。

2 結(jié)果

2.1 1-MH的圖譜認(rèn)證

氣相色譜-質(zhì)譜法分析以選擇離子監(jiān)測質(zhì)荷比m/z114色譜圖中1-MH的峰面積和質(zhì)荷比m/z86色譜圖中SKF-525A的峰面積進行計算，1-MH保留時間為6.9 min，質(zhì)荷比m/z114為分子離子峰，質(zhì)荷比m/z42為酰胺鍵斷裂后的碎片離子峰。均得到了良好的色譜響應(yīng)，見圖1。

圖1 1-MH的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖Fig.1 The chromatogram and mass spectrum of 1-MH

2.2 線性范圍與檢出限考察

精密吸取對照品儲備液適量，并用甲醇稀釋成濃度為0.1、1.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各取1 μ L按照“1.3”項下的條件進樣分析。以1-MH與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo) （y） ，以1-MH濃度為橫坐標(biāo) （x） ，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y= 9. 392x+ 6.6891 （r = 0.9992） ，在0.1～100.0 μ g/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將最低濃度點繼續(xù)稀釋進樣，按照3倍信噪比計算，檢出限為0.01 μ g/mL。

2.3 方法精密性與重復(fù)性考察

取濃度為10.0 μ g/mL的1-MH對照品溶液，連續(xù)進樣 6 次，每次進樣1 μ L，記錄1-MH的峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)差 （relative standard deviation，RSD） 為1.1%，表明儀器精密度良好。精密稱取同一批哈蟆油樣品粉末 （約 0.4 g，過3號篩），共6份，分別加入1-MH對照品，制備成質(zhì)量濃度為10.0 μ g/mL的供試品粉末，按照樣品處理方法進樣分析后得到1-MH峰面積的RSD為2.03 %。

2.4 方法準(zhǔn)確性實驗

精密稱取同一批蛤蟆油樣品粉末 （約 0.4 g，過3號篩），共9份，分別加入1-MH對照品，制備成質(zhì)量濃度為1.0、10.0、100.0 μ g/mL的供試品粉末，每一質(zhì)量濃度制備3份，按“1.2”項下方法處理樣品，根據(jù)測得量和加入量 （1.0、10.0、100.0 μ g/mL） 1-MH計算3個濃度的平均加樣回收率分別為95.33%、98.42%、96.70%，RSD分別為0.6%、0.8%和 1.4%。

2.5 蛤蚧各組織中1-MH分布

根據(jù)蛤蚧解剖特點，各個組織部位相對分明，故分為5個部位分別測定，結(jié)果顯示，蛤蚧各部位均檢測出1-MH成分，和骨骼肌相關(guān)的組織含量均>1 μ g/g，而不含或較少含骨骼肌的組織<1 μ g/g。蛤蚧尾部1-MH含量超過身體其他部位10倍左右，見表1。

表1 蛤蚧各部位組織中1-MH的含量 （n = 3）Tab.1 Content of 1-MH in gecko tissues （n = 3）

2.6 動物類中藥材1-MH分布

結(jié)果顯示，蛤蟆油、烏蛇、海蛇和蛤蚧中檢測1-MH分別為4.45、2.84、10.43、10.73 μ g/g，而地龍、全蝎、阿膠和紫河車樣品中未檢出1-MH。

3 討論

抗炎作用、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和平喘作用是蛤蟆油、烏蛇、海蛇、蛤蚧共有的藥理作用[13-16]，這幾種藥材均檢出了1-MH，與已有實驗研究[2-7]的1-MH抗炎、消除活氧和自由基、止咳平喘等藥理活性相符合，推測1-MH可能為這幾種中藥材共同的藥效作用物質(zhì)之一。

蛤蚧尾部1-MH含量高于蛤蚧身體其他部位，這與傳統(tǒng)中醫(yī)注重使用蛤蚧尾部相吻合?！独坠谥苏摗分杏涊d“凡使蛤蚧，毒在眼，勿傷尾也”[17]?！稁X表錄異》中有文“力在尾，不具者無功”[18]?，F(xiàn)代中藥藥理研究[19]表明無尾蛤蚧與尾全蛤蚧相比功效有所下降，價格也差別很大。

1-MH化學(xué)結(jié)構(gòu)與苯妥英類似，在不同pH條件下存在烯醇互變現(xiàn)象，堿性條件下主要以極性較大的內(nèi)酰亞胺形式存在，不利于有機溶劑提取。且堿性條件下酰胺鍵易發(fā)生水解開環(huán)降低提取率，故本實驗采用強酸性條件（pH=2）提取，效果良好。

本實驗建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，能夠準(zhǔn)確測定動物類中藥材中1-MH含量，操作簡便，方法檢出限、回收率、精密性等技術(shù)指標(biāo)均符合要求。1-MH是多種中藥材的共有成分，推測其可能為蛤蚧、烏蛇、海蛇和蛤蟆油的共同藥理活性物質(zhì)之一。本研究探索動物類中藥材藥理作用物質(zhì)基礎(chǔ)，對國家中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化建立具有一定意義，同時為進一步研究動物體內(nèi)1-MH的生成機制提供參考。

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典一部[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：255-256.

[2]LAUNAY M，POTIN D，MAILLET M，et al. Hydantoin compounds useful as anti-inflammatory agents [P]. US，2002143035. 2002-10-03.

[3]LU HB，KONG DJ，WU B，et al. Synthesis and evaluation of anti-inflammatory and antitussive activity of hydantoinderivatives [J]. Lett Drug Des Disc，2012，9 （6） ：638-642. DOI：10.2174/157018012800673092.

[4]高利娜，楊爽，劉俊亭，等. 5-羥基-1-甲基海因?qū)Π俨菘菟麓笫竽I毒性防護作用的實驗研究[J]. 中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2015，27 （4） ：246-249. DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-4352.2015.04.004.

[5]韓冬，董雪蓮，邱智東. 1-甲基海因?qū)ο笫竽Ｐ偷钠酱饔眉捌錂C制[J].吉林大學(xué)學(xué)報 （醫(yī)學(xué)版） ，2014，40 （3） ：543-548.DOI：10.13481/j.1671-587x.20140316.

[6]羅海燕，雷羽，熊亮，等. 青環(huán)海蛇中有效物質(zhì)1-甲基海因的含量測定[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2010，21 （4） ：882-883. DOI：10.3969/j.issn.1008-0805.2010.04.055.

[7]張嵩，王維寧，陳芳芳，等. 蛤蟆油與類似品和偽品的質(zhì)量評價[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2012，29 （12） ：951-958. DOI：10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2012.12.008.

[8]高竹青，劉俊亭，王春媛，等. 對中國藥典用1-甲基海因鑒別蛤蟆油方法的商榷[J]. 中南藥學(xué)，2013，11 （8） ：608-610. DOI：10.7539/j.issn.1672-981.2013.08.014.

[9]WYSS M，KADDURAHDAOUK R. Creatine and creatinine metabolism [J]. Physiol Rev，2000，80 （3） ：1107.

[10]GOODNOW R A，KANG L. Hydantoin-containing glucokinase activators [P]. CH，CN1427838. 2003-07-02.

[11]陳冰，王詩涵，徐陽，等. HPLC法測定脫脂林蛙油膠囊中1-甲基海因的含量[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014，5：196-197.

[12]王永生，張輝，林喆，等. RP-HPLC測定蛤蟆油中1-甲基海因的含量[J]. 中國藥學(xué)雜志，2008，2：146-148. DOI：10.3321/j.issn：1001-2494.2008.02.020.

[13]楊士慧，趙雨，張梅，等. 蛤蟆油非水溶性成分酶解物藥理活性研究[J]. 食品科技，2012，37 （4） ：44-47. DOI：10.13684/j.cnki.spkj.2012.04.006.

[14]顧劍萍，林乾良. 烏梢蛇的藥理研究初報[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1986，3 （4） ：4-8.

[15]蔣璐，汪國威，李揚，等. 海蛇風(fēng)濕膠囊抗風(fēng)濕作用的藥效研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2017，28 （3） ：310-313. DOI：10.19378/j.issn.1003-9783.2017.03.010.

[16]周燁，易蔚. 蛤蚧的藥理作用及其治療哮喘的作用機制研究綜述[J]. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，14 （4） ：79-80. DOI：10.3969/j.issn.1008-7486.2011.04.047.

[17]南北朝雷敩. 雷公炮炙論[M]. 上海：中醫(yī)學(xué)院出版社，1986：74-75.

[18]商壁. 嶺表錄異校補[M]. 南寧：廣西民族出版社，1988：168.

[19]胡紹蘭. 尾全蛤蚧與無尾蛤蚧體活性比較[J]. 北京中醫(yī)，1996，5：37-38.