激活A(yù)MPK通過(guò)下調(diào)microRNA?21水平抑制肺癌細(xì)胞增殖及侵襲能力

王波

【摘要】? 目的 探討激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是否可抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及其具體作用機(jī)制，為防治肺癌尋求新靶點(diǎn)。方法 以培養(yǎng)的人A549肺腺癌細(xì)胞株為研究對(duì)象，外源性給予AMPK激動(dòng)劑二甲雙胍干預(yù)細(xì)胞，采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況，采用逆轉(zhuǎn)錄（RT）?PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞微小RNA?21（miR?21）水平，蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞p?/t?AMPK、PTEN、p?/t?Akt水平，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移及侵襲情況。結(jié)果 二甲雙胍可抑制A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，對(duì)穿膜細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間存在差異（P均<0.05，與對(duì)照組比較）;二甲雙弧可通過(guò)激活A(yù)MPK下調(diào)細(xì)胞miR?21水平，上調(diào)PTEN表達(dá)，抑制Akt活性抑制A549細(xì)胞增殖及遷移侵襲（P均<0.05，與對(duì)照組比較）;轉(zhuǎn)染miR?21 mimics可逆轉(zhuǎn)AMPK的作用（P均<0.05，與二甲雙胍組比較）。結(jié)論 通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)，下調(diào)miR?21水平可抑制A549細(xì)胞的增殖及遷移侵襲，提示激活A(yù)MPK具有潛在治療肺癌的作用，為研發(fā)新的靶向治療藥物提供了思路。

【關(guān)鍵詞】? 肺癌;腺苷酸活化蛋白激酶;微小核糖核酸?21;PTEN

【Abstract】? Objective? To discuss whether the activation of AMP?activated protein kinase（AMPK）can inhibit the proliferation，migration and invasion of A549 cells and unravel the underlying mechanism，aiming to provide a novel target for lung cancer therapy. Methods? Human lung adenocarcinoma A549 cells were intervened with the AMPK agonist of metformin. MTT assay was applied to analyze the proliferative ability of tumor cells in different groups. qRT?PCR was utilized to measure the expression level of microRNA?21 （miR?21）. Western blot was performed to detect the expression levels of p?/t?AMPK，PTEN and p?/t?Akt proteins. Transwell invasion assay was utilized to analyze the migration and invasion of A549 cells. Results? Metformin could inhibit the proliferation，migration and invasion of A549 cells. The quantity of trans?membrane cells significantly differed among different groups （all P<0.05，compared with the control group）. Metformin could down?regulate the expression level of miR?21，up?regulate the expression level of PTEN，suppress the Akt activity and inhibit the proliferation，migration and invasion of A549 cells by activating the AMPK signaling pathway （all P<0.05，compared with the control group）. Transfection with miR?21 mimics reversed the effect of AMPK （all P<0.05，compared with the metformin group）. Conclusions? Metformin inhibits the proliferation，migration and invasion of A549 cells by up?regulating the expression of PTEN and down?regulating the expression of miR?21，prompting that activating the AMPK signaling pathway serves as a potential therapeutic target to treat lung cancer，providing evidence for exploring novel target medicines.

【Key words】? Lung cancer;AMP?activated protein kinase;MicroRNA?21;PTEN

原發(fā)性支氣管肺癌（以下簡(jiǎn)稱肺癌）是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率均高居首位，嚴(yán)重威脅人類生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)近年來(lái)我國(guó)新發(fā)肺癌病例數(shù)73.33萬(wàn)（男性50.93萬(wàn)，女性22.40萬(wàn)），因肺癌死亡人數(shù)達(dá)到61.02萬(wàn)（男性43.24萬(wàn)，女性17.78萬(wàn)）[1]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）被認(rèn)為是真核生物的“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”，可調(diào)節(jié)下游通路中與膽固醇代謝、脂肪酸合成及蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)揮其能量調(diào)節(jié)器的功能[2]。近年來(lái)的研究表明，激活A(yù)MPK信號(hào)通路對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和存活有抑制作用。實(shí)體腫瘤中，AMPK活性往往較低。Zheng等[3]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌中AMPK雖然有表達(dá)，但其活性缺失卻是一個(gè)普遍存在的現(xiàn)象。目前的研究顯示AMPK有望成為非小細(xì)胞肺癌治療的靶點(diǎn)，但其具體的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步的探究[4]。本研究以培養(yǎng)的人A549肺腺癌細(xì)胞株為研究對(duì)象，外源性給予AMPK激動(dòng)劑二甲雙胍干預(yù)細(xì)胞，通過(guò)MTT、逆轉(zhuǎn)錄（RT）?PCR、蛋白免疫印跡法及Transwell等方法研究二甲雙胍對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549增殖、遷移侵襲以及對(duì)microRNA-21（miR?21）水平及其下游PTEN?PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，旨在為論證激活A(yù)MPK作為治療肺癌的潛在途徑提供依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞株和試劑選擇

人A549肺腺癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，二甲雙胍購(gòu)自Selleck，Compound C 購(gòu)自Merck Millipore ，RNA提取試劑盒購(gòu)自陜西先鋒生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及TaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司，PTEN、p?Akt、t?Akt、p?AMPK、t?AMPK、GAPDH抗體購(gòu)自CST，細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning，PCR擴(kuò)增儀及Western電泳儀購(gòu)自BIO?RAD，MTT試劑購(gòu)自西唐生物科技有限公司。

二、試驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞用含有10%滅活胎牛血清，青霉素（100 U/ml），鏈霉素（100 μg/ml）的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.? ?噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞活性

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞消化貼壁細(xì)胞后，加入含10%血清的培養(yǎng)基，制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以約6×103個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，細(xì)胞全部貼壁后，棄去上清，取出96孔板，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μl，然后置于37℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去上清，每孔加DMSO 150 μl，置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解;設(shè)定空白對(duì)照孔調(diào)零，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。并計(jì)算平均增殖率，增殖率=實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值×100%，整理保存數(shù)據(jù)。

3.? ?RT?PCR檢測(cè)miR?21水平

用RNAfast1000?總RNA極速抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA，配制逆轉(zhuǎn)錄cDNA反應(yīng)液用于miR?21及U6的檢測(cè)，將逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA稀釋10倍至50 ng/μl以下應(yīng)用BIO?RAD PCR實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增儀的操作方法進(jìn)行反應(yīng)，分析溶解曲線，計(jì)算結(jié)果。

4.? ?蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PTEN及p?Akt水平

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)干預(yù)細(xì)胞后提取蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白含量、變性，SDS?PAGE電泳，轉(zhuǎn)印后取出硝酸纖維素膜進(jìn)行免疫反應(yīng)，膜用濾紙吸干，將預(yù)先配制的發(fā)光液均勻滴上，BIO?RAD成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶，分析結(jié)果。

5.? ?Transwell小室遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定腫瘤細(xì)胞遷徙及侵襲能力

用Matrigel膠與無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶7稀釋，每個(gè)Transwell小室上加入100 μl稀釋液，37 ℃孵育箱孵育 Transwell 小室至少1 h 使膠凝固，制備細(xì)胞懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)（遷移實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)24 h，侵襲實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)48 h），顯微鏡下取小室的上、下、左、右、中心5個(gè)視野部位計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以x±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD?t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、二甲雙胍抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力

將A549細(xì)胞分為對(duì)照組、二甲雙胍組，進(jìn)行Transwell遷移及侵襲試驗(yàn)，結(jié)果顯示二甲雙胍干預(yù)后，A549細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯受到抑制。對(duì)穿膜細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

二、二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力

將A549細(xì)胞分為對(duì)照組及二甲雙胍組，提取細(xì)胞總蛋白，蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞p?AMPK水平，與對(duì)照組比較，二甲雙胍組p?AMPK水平明顯升高（圖2A，P<0.05）。預(yù)先給予AMPK抑制劑Compound C可抑制二甲雙胍誘導(dǎo)的p?AMPK水平上調(diào)（P<0.05，圖2B）。MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果表明特異性抑制AMPK，二甲雙胍抑制A549細(xì)胞增殖的作用被逆轉(zhuǎn)（圖2C，P<0.05，與二甲雙胍組比較）。

預(yù)先給予AMPK抑制劑Compound C可逆轉(zhuǎn)二甲雙胍抑制A549細(xì)胞遷移及侵襲的能力。對(duì)穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3，P<0.05，與二甲雙胍組比較）。

三、激活A(yù)MPK抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的分子機(jī)制

1.miR?21水平

與對(duì)照組相比，二甲雙胍干預(yù)可下調(diào)細(xì)胞中miR?21水平（P<0.05），而預(yù)先給予AMPK抑制劑Compound C可逆轉(zhuǎn)二甲雙胍對(duì)miR?21水平的影響（圖4，P <0.05，與二甲雙胍組比較）。

2. PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路

與對(duì)照組相比，二甲雙胍干預(yù)可明顯上調(diào)細(xì)胞中PTEN水平，而預(yù)先抑制AMPK可逆轉(zhuǎn)二甲雙胍對(duì)PTEN水平的影響;二甲雙胍干預(yù)可下調(diào)A549細(xì)胞中p?Akt水平，而預(yù)先給予Compound C 可以逆轉(zhuǎn)二甲雙胍對(duì)p?Akt的抑制作用，見圖5。

3.? miR?21介導(dǎo)了激活A(yù)MPK抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用

為了進(jìn)一步明確激活A(yù)MPK是否通過(guò)下調(diào)miR?21水平抑制A549細(xì)胞增殖。用miR?21 mimics轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后提取總RNA，qRT?PCR檢測(cè)細(xì)胞miR?21水平。結(jié)果表明miR?21 mimics可明顯上調(diào)A549細(xì)胞中miR?21水平（圖6A，P<0.05，與對(duì)照組比較）。二甲雙胍處理可明顯抑制A549細(xì)胞增殖（P<0.05，與對(duì)照組比較），而預(yù)先給予miR?21 mimics可逆轉(zhuǎn)二甲雙胍抑制細(xì)胞增殖的作用（P<0.05，與二甲雙胍組比較），見圖6B。

為了進(jìn)一步明確激活A(yù)MPK是否通過(guò)下調(diào)miR?21水平抑制A549細(xì)胞侵襲，將A549細(xì)胞分為對(duì)照組、二甲雙胍組、miRNA mimics NC+二甲雙胍組、miR?21 mimics +二甲雙胍組，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力。結(jié)果表明二甲雙胍處理可明顯抑制A549細(xì)胞遷移及侵襲，而預(yù)先給予miR?21 mimics可逆轉(zhuǎn)二甲雙胍的抑制作用，對(duì)穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7，P<0.05，與二甲雙胍組比較）。

將A549細(xì)胞分為對(duì)照組、二甲雙胍組、miRNA mimics NC+二甲雙胍組、miR?21 mimics +二甲雙胍組。miRNA mimics NC或miR?21 mimics 預(yù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h，然后加入10 ml吡格列酮干預(yù)24 h，提取蛋白質(zhì)，檢測(cè)PTEN和p?/t?Akt水平。結(jié)果顯示二甲雙胍處理可上調(diào)PTEN水平，而預(yù)先給予miR?21 mimics可逆轉(zhuǎn)二甲雙胍對(duì)PTEN水平的影響（圖8A）。二甲雙胍處理可下調(diào)p?Akt水平，而預(yù)先給予miR?21 mimics可逆轉(zhuǎn)二甲雙胍對(duì)p?Akt水平的影響（圖8B）。

討論

miR?21基因是最早在人類基因組中檢測(cè)到的miRNA之一，在多種不同類型腫瘤組織中均明顯上升，與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移侵襲、血管生成和抗藥性等生物學(xué)行為相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，miR?21在肺癌發(fā)病和治療過(guò)程中的作用逐漸引起關(guān)注[5?9]。PTEN是miR?21的重要靶蛋白之一，miR?21可以通過(guò)下調(diào)PTEN水平誘導(dǎo)多種細(xì)胞增殖。PI3K/Akt信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、遷移、分化、血管生成等一系列病理生理過(guò)程。研究表明，Akt可通過(guò)磷酸化調(diào)控下游靶蛋白的活性或功能[10?11]。例如，Akt可磷酸化雙微基因2蛋白，抑制p53蛋白的功能，促進(jìn)細(xì)胞存活;可通過(guò)磷酸化BAD、FXKR抑制其生物活性，抑制細(xì)胞凋亡;促進(jìn)NF?κB磷酸化，抑制細(xì)胞凋亡;可通過(guò)磷酸化mTOR，上調(diào)Skp2水平，下調(diào)p27，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究未系統(tǒng)檢測(cè)Akt下游關(guān)鍵靶蛋白的活性變化，但大量的研究已建立了它們之間的相關(guān)性。

作為腫瘤重要的惡性生物學(xué)行為之一，遷移及侵襲加劇了腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，影響預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中miR?21表達(dá)的上調(diào)，加劇了腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲[12]。本研究中，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)過(guò)表達(dá)miR?21可以逆轉(zhuǎn)二甲雙胍對(duì)A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的抑制作用。

綜上所述，二甲雙胍可通過(guò)激活A(yù)MPK下調(diào)miR?21水平，進(jìn)而負(fù)性調(diào)控PTEN?PI3K/Akt信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞增殖;此外，二甲雙胍還可抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力，機(jī)制也與激活A(yù)MPK，下調(diào)miR?21水平有關(guān)，提示AMPK可能是防治肺癌的新靶點(diǎn)，但要應(yīng)用于臨床過(guò)程，尚需進(jìn)一步研究、驗(yàn)證。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2018?07?10）

（本文編輯：楊江瑜）