固相萃取結(jié)合氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測定高酸水果中48種農(nóng)藥殘留

張博倫，龐國芳，馮 春，李建勛，吳興強，胡雪艷，范春林*

(1.北京工商大學 食品學院，北京 100048；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；3.河北大學 化學與環(huán)境科學學院，河北 保定 071002)

柚子、橙子、菠蘿、山楂等具有較強酸性口感的水果含有豐富的可溶性固形物、維生素C，并具有氣味芬芳、口感獨特、益于身體健康等特點，成為廣受歡迎的水果。這類pH<3.5的水果通常被稱為高酸水果，其富含的果酸能夠預防心血管疾病、促進人體新陳代謝、改善人體酸堿平衡[1]。然而在水果種植和儲藏過程中，廣泛使用了各類農(nóng)藥[2-4]。超標的農(nóng)藥殘留會對人體造成傷害，對生態(tài)環(huán)境也造成不利影響[5-6]。

目前對于水果中農(nóng)藥殘留量的主要檢測方法有氣相色譜法(GC)[7-9]、高效液相色譜法(HPLC)[10-11]及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-13]。由于水果種類多、基質(zhì)復雜，存在大量干擾因素，而且高酸水果含有較多的果酸及風味物質(zhì)，對其農(nóng)殘檢測帶來了較大困難[14]。為了得到準確的檢測結(jié)果，樣品前處理方法的優(yōu)化尤為重要。目前，水果樣品的前處理方法有固相萃取法(SPE)[15]、QuEChERS法[16]、固相微萃取法(SPME)[17]、基質(zhì)固相分散法(MSPD)[18]、液液萃取法(LLE)[19]和超聲輔助提取法[20]。固相萃取法是利用選擇性吸附和選擇性洗脫的原理，通過使用萃取柱在保留被檢測物質(zhì)的同時去除雜質(zhì)，再洗脫被檢測物質(zhì)，以達到快速分離凈化與濃縮的目的，降低了樣品基質(zhì)的干擾，提高了檢測靈敏度。

日常分析中發(fā)現(xiàn)，以GB 23200.8-2016為代表的廣適方法在對高酸水果進行檢測時，加標回收實驗結(jié)果與其他果蔬相比較差。本文根據(jù)GB 2763-2016中規(guī)定的食品中農(nóng)藥最大殘留限量(MRL)，結(jié)合日常檢驗工作中的常檢農(nóng)藥，選取48種具有代表性的農(nóng)藥作為研究對象，將固相萃取法與GC-MS/MS結(jié)合并進行優(yōu)化后，用于高酸水果基質(zhì)中的農(nóng)殘檢測，結(jié)果滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A-7000氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)，配7693A自動液體進樣器；KDC-40低速離心機(中國中佳公司)；AH-30全自動均質(zhì)儀(?？苾x器有限公司)；Rotavapor R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Bucci公司)；N-EVAP 112型氮吹濃縮儀(美國Organomation Associates公司)；SR-2DS水平振蕩器(日本Taitec公司)；MX-S渦旋攪拌器(美國Scilogex公司)；KQ-600B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PL602電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Milli-Q超純水儀(Millipore公司)。

48種農(nóng)藥標準品(純度≥95%)及內(nèi)標環(huán)氧七氯均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、正己烷(美國Honeywell公司)和甲苯(美國Fisher公司)均為色譜純；SPE柱(Sep-Pak Vac 6cc CarbonNH2Cartridges，美國Waters公司)；氨基凈化柱(ProElutNH21 000 mg/6 mg，北京Dikma公司)；其他未作特殊說明的試劑均為分析純。水果購于當?shù)爻小?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1色譜-質(zhì)譜條件色譜柱：Agilent DB-1701(30 m×250 μm×0.25 μm)；恒流模式流速：0.88 mL/min；載氣：高純氦氣(99.999%)；碰撞氣：高純氮氣(99.999%)；進樣口溫度：250 ℃；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流；溶劑延遲：6 min；EI離子源溫度：230 ℃；EI源能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；色譜柱升溫步驟：初始溫度40 ℃保持1 min，以30 ℃/min升至130 ℃，再以5 ℃/min升至250 ℃，最后以10 ℃/min升至300 ℃，保持5 min；掃描模式：MRM多重反應監(jiān)測，分為5段：7.00～18.60 min、18.60～22.50 min、22.50～26.00 min、26.00～28.90 min、28.90～38.00 min。

1.2.2樣品的制備柚子、橙子、菠蘿樣品放入打漿機內(nèi)打碎，山楂去核后打碎。將打碎后的樣品裝入小瓶后加蓋、密封，-18 ℃低溫保存。使用前再恢復至室溫。

1.2.3標準品溶液的配制準確稱取10 mg標準品于10 mL棕色容量瓶內(nèi)，用甲醇溶解并定容。得到每種標準品的單一標準液后，混合配制成10 mg/L混合標準液。將混合標準液按實驗所需的檢測濃度逐級稀釋，低溫保存。內(nèi)標溶液為100 μg/L環(huán)氧七氯甲醇溶液。

1.2.4化合物MRM方法的建立對2 mg/L農(nóng)藥標準液在m/z50～550范圍內(nèi)進行SCAN全掃描，根據(jù)得出的色譜圖及全掃描譜圖，確定每種農(nóng)藥的保留時間，以質(zhì)荷比較大、豐度較高的特征離子作為MRM前級離子。用前級離子信息建立子離子掃描模式的方法，使碰撞電壓在5～40 eV間每隔5 eV進行1次碰撞。每種碰撞能下根據(jù)譜圖選出豐度較高的兩個特征產(chǎn)物離子作為MRM的子離子。兩個子離子中豐度較高的用于定量分析，另一個用于定性分析。

1.2.5固相萃取前處理過程稱取10.0 g水果樣品(精確至0.01 g)于100 mL離心管中，加入40 mL含1%(體積分數(shù))醋酸的乙腈提取液，10 000 r/min均質(zhì)1 min。加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，振蕩5 min，于4 200 r/min離心5 min后，取20 mL上清液于150 mL雞心瓶中，40 ℃水浴加熱旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2 mL，待凈化。SPE凈化柱內(nèi)加入高約1 cm的無水硫酸鈉，用5 mL乙腈-甲苯(體積比3∶1，下同)預洗SPE凈化柱，同時輕敲凈化柱排出柱內(nèi)氣泡，棄去下方流出液。待液面略高于硫酸鈉頂部時，將濃縮液轉(zhuǎn)入凈化柱，下接50 mL雞心瓶。用2 mL乙腈-甲苯(3∶1)沖洗雞心瓶，將洗滌液轉(zhuǎn)移至凈化柱內(nèi)，重復3次。柱上接25 mL儲液器，以25 mL乙腈-甲苯(3∶1)洗脫。收集完畢后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約0.5 mL，氮吹至近干，加入1 mL正己烷定容，超聲溶解后經(jīng)0.22 μm尼龍膜過濾，供GC-MS/MS檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將各農(nóng)藥儲備液稀釋至2 mg/L，分別進行一級質(zhì)譜掃描，確定各農(nóng)藥的特征離子和最優(yōu)的碰撞電壓。各農(nóng)藥的保留時間及其他離子信息見表1，總離子流圖(TIC)見圖1。

表1 48種農(nóng)藥的保留時間(RT)、離子信息、碰撞能(CE)、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限及定量下限Table 1 Retention times(RT),ion pair information,collision energy(CE),linear equations,correlation coefficients(r2),limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) for 48 pesticides

(續(xù)表1)

No．CompoundRT(min)Quantifiertransition(CE/V)Qualifiertransition(CE/V)Linearequationr2LOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)38Tebufenpyrad(吡螨胺)29 23333 0/171 0(15)333 0/276 0(5)y=1 27x0 99920 51 039Endosulfansulfate(硫丹硫酸酯)29 43271 9/237 0(15)387 0/253 0(5)y=10 62x-0 130 99781 55 040Fenpropathrin(甲氰菊酯)29 83265 0/210 0(10)265 0/89 0(10)y=6 24x-0 040 99630 51 041Tebuconazole(戊唑醇)29 86250 0/125 0(15)250 0/153 0(10)y=0 49x-0 010 99901 55 042Metconazole(葉菌唑)29 87125 0/89 0(20)125 0/99 0(20)y=5 22x-0 050 99835 010 043Fenoxycarb(苯氧威)29 94255 0/186 0(10)255 0/129 0(25)y=3 06x-0 050 99921 55 044Pyriproxyfen(吡丙醚)30 06136 0/78 0(25)136 0/96 0(15)y=2 86x-0 030 99851 05 045Tetradifon(三氯殺螨砜)30 89356 0/229 0(10)356 0/159 0(10)y=3 84x+0 030 99711 55 046Pyridaben(噠螨靈)32 12147 0/117 0(25)147 0/132 0(15)y=2 74x-0 030 99811 010 047Permethrin(氯菊酯)32 37183 0/168 0(15)183 0/153 0(15)y=0 17x0 99815 010 048Etofenprox(醚菊酯)32 92163 0/135 0(10)163 0/107 0(15)y=1 83x-0 010 99781 05 049Indoxacarb(茚蟲威)36 55202 9/134 0(15)202 9/106 0(10)y=10 47x+0 300 99705 010 0

圖1 49種農(nóng)藥(含內(nèi)標)混合標準液(2 mg/L)的總離子流圖(TIC)Fig.1 TIC chromatogram of 49 pesticides(including ISTD) standard solution(2 mg/L)the number denoted was the same as that in Table 1

圖2 5種提取液對應的回收率與平行性合格的農(nóng)藥占比Fig.2 Percentage of 48 pesticides with qualified REC&RSD by using different extractant

2.2 提取液的優(yōu)化

對提取液的種類進行優(yōu)化。在柚子基質(zhì)中加入100 μg/kg的農(nóng)藥混標，比較了乙腈(MeCN)、正己烷、丙酮、甲醇與含1%(體積分數(shù))醋酸的酸化乙腈對農(nóng)藥的提取效果。對回收率在70%～120%且RSD<20%的農(nóng)藥數(shù)量進行了統(tǒng)計，結(jié)果如圖2。結(jié)果表明，正己烷極性相對較弱，不利于極性較大農(nóng)藥的提??；使用丙酮時凈化效果較差，提取液中色素等雜質(zhì)較多，影響檢測結(jié)果并造成儀器污染，故本實驗選用酸化乙腈作為提取液。

2.3 提取時間的優(yōu)化

加入氯化鈉可以增強鹽析作用，加入無水硫酸鎂可除去樣品中水分。對柚子樣品加入提取液及兩種無機鹽后比較了不同振蕩時間(5、10、15、20 min)的提取效果。結(jié)果顯示，振蕩時間對提取效果無明顯影響。這是因為均質(zhì)過程中提取液對樣品中的農(nóng)藥提取充分，為提高實驗效率，本實驗選擇振蕩時間為5 min。

2.4 固相萃取凈化柱的優(yōu)化

由于高酸水果中的果酸含量較高，傳統(tǒng)的SPE法難以達到良好的凈化效果。通過在柚子基質(zhì)中進行農(nóng)藥加標回收實驗，發(fā)現(xiàn)串聯(lián)使用CarbonNH2與ProElutNH2萃取柱的回收率明顯提升，說明該萃取柱對樣品中的果酸等雜質(zhì)組分有較好的凈化效果，而PSA等堿性凈化填料的加入會對酸性農(nóng)藥的檢測造成較大干擾，因此選擇串聯(lián)使用CarbonNH2與ProElutNH2萃取柱進行萃取。

2.5 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應是樣品中其他組分對待測物測定值的影響，導致待測組分在進行儀器分析時的響應出現(xiàn)增強或抑制[21]。選用柚子的空白樣品作為基質(zhì)，通過測定濃度梯度為1、5、10、20、50、100 μg/kg的基質(zhì)標準溶液和相對應的溶劑標準溶液，建立標準曲線，通過公式“(基質(zhì)標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率-1)×100%”計算基質(zhì)效應。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分農(nóng)藥具有明顯的基質(zhì)效應，部分有機磷類(馬拉硫磷高達109%)和擬除蟲菊酯類(聯(lián)苯菊酯高達116%)農(nóng)藥最為明顯。為抵消基質(zhì)效應對檢測結(jié)果的影響，本研究使用基質(zhì)匹配標準曲線對樣品進行定量分析。

2.6 線性范圍、檢出限與定量下限

以柚子的空白樣品作為基質(zhì)進行定量加標，制備含量分別為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg的基質(zhì)標準樣品，在優(yōu)化實驗條件下進行測定。結(jié)果表明，48種農(nóng)藥的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.995 4～0.999 8，方法的線性范圍為1.0～100.0 μg/kg。以3倍信噪比(S/N=3)確定檢出限，高于10倍信噪比的加標濃度確定定量下限。48種農(nóng)藥的檢出限為0.5～5.0 μg/kg，定量下限為1.0～10.0 μg/kg(見表1)。表明該方法的萃取凈化效果較好，檢測的農(nóng)藥范圍廣，適用于多種水果基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的檢測。

2.7 回收率與精密度

在菠蘿、柚子、橙子和山楂空白樣品中進行加標回收率實驗，加標水平為10、50、100 μg/kg，每個加標濃度做5個平行樣品，回收率與相對標準偏差(RSD)見表2。48種農(nóng)藥在3個加標水平下的平均回收率分別為70.7%～118.0%、72.1%～116.3%、71.0%～115.4%，RSD不大于9.7%。方法的準確度和精密度較為理想，能夠用于實際樣品中農(nóng)藥殘留的準確定量。

表2 4種水果中48種農(nóng)藥的回收率及相對標準偏差(n=5)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of 48 pesticides spiked in 4 kinds of fruit(n=5)

(續(xù)表2)

No．Spiked(μg/kg)Recovery/%RSD/%PineapplePomeloOrangeHawthornPineapplePomeloOrangeHawthorn3010 50 10096 8 94 6 97 084 2 86 1 95 3101 4 81 1 87 279 4 93 7 88 16 7 7 0 7 53 6 3 8 7 49 1 6 7 5 28 1 2 0 3 33110 50 10084 4 95 2 92 581 9 73 0 93 5104 7 73 1 82 986 9 93 4 96 32 3 8 6 8 50 3 2 9 6 88 3 3 8 7 54 8 2 6 3 43210 50 10094 9 98 1 92 6103 3 75 5 95 993 8 72 3 86 776 1 91 8 92 70 6 7 3 5 83 3 3 9 5 62 4 5 5 5 17 1 3 5 2 03310 50 10090 3 95 7 101 387 2 95 5 98 0100 4 95 5 91 685 5 91 1 101 39 7 2 6 4 95 2 3 1 7 45 1 8 8 3 04 3 4 3 5 33410 50 10097 6 101 4 96 8106 7 87 6 95 8115 0 78 5 87 490 9 95 2 96 04 8 2 2 6 80 2 1 9 4 25 6 5 8 9 24 4 5 5 2 43510 50 100115 2 101 1 84 676 1 81 6 92 176 8 92 5 103 291 0 115 8 78 36 4 7 9 2 85 2 5 5 1 74 3 5 4 7 63 0 4 5 5 43610 50 10085 6 108 1 96 393 1 85 2 92 8114 3 77 5 87 683 3 86 8 92 23 9 6 3 4 34 0 3 7 4 32 7 7 8 7 12 3 1 4 1 13710 50 10089 7 92 0 89 690 1 92 1 93 199 0 100 9 96 370 7 86 8 94 34 2 4 5 2 80 9 6 1 2 13 0 7 9 3 57 1 2 7 4 03810 50 10083 8 95 3 92 786 6 79 1 82 6116 5 90 9 91 795 4 89 7 91 17 0 6 5 4 51 5 7 6 4 55 2 6 8 1 37 2 3 3 4 83910 50 10089 8 112 5 74 092 5 80 4 98 674 6 73 2 96 790 4 79 2 92 33 8 4 4 9 27 4 4 8 3 73 1 5 2 2 23 7 8 7 6 44010 50 10093 3 100 5 91 476 0 90 7 94 387 2 99 0 93 583 0 88 0 82 15 7 2 0 4 55 3 4 6 8 44 3 5 9 1 27 4 3 6 2 64110 50 10097 2 95 6 90 689 2 74 8 96 4103 5 79 7 88 582 9 89 3 82 93 5 0 3 5 32 0 6 0 5 03 4 4 4 4 66 1 4 1 2 74210 50 10093 3 86 9 92 489 4 85 9 96 8109 0 80 4 87 295 2 87 2 87 26 7 6 8 5 90 2 4 1 6 07 7 0 6 5 18 6 4 7 7 74310 50 10099 2 90 0 75 489 4 86 2 88 493 7 90 3 92 789 6 83 0 82 78 2 9 0 4 23 1 0 2 3 75 8 6 9 3 46 1 3 9 5 94410 50 10097 7 95 7 89 189 4 81 9 72 797 4 94 2 92 189 7 85 7 94 05 3 2 2 4 41 7 3 2 3 17 0 6 7 0 94 8 3 5 2 34510 50 10095 7 98 4 91 785 8 88 6 98 492 9 99 5 88 399 0 112 9 95 93 1 6 0 5 84 6 3 3 6 76 8 4 8 2 78 6 3 2 2 44610 50 100103 1 94 1 85 997 6 79 7 101 7111 7 86 9 87 985 5 94 2 94 74 5 5 1 3 32 5 2 4 6 97 5 8 1 1 63 9 1 7 5 04710 50 100101 4 91 8 89 494 8 94 2 111 780 7 101 1 91 891 5 99 2 86 77 0 5 8 2 94 5 1 4 6 39 1 6 6 3 55 7 6 4 5 44810 50 10089 2 88 4 90 792 4 97 0 82 087 1 92 2 93 475 4 94 4 86 73 2 8 4 7 04 9 5 6 5 19 3 5 1 2 64 6 1 3 4 74910 50 10091 5 84 8 83 794 2 83 7 91 7106 2 73 8 78 989 2 82 9 96 36 6 3 8 7 64 1 1 4 5 51 9 2 9 5 83 0 4 8 6 4

the number denoted was the same as that in Table 1

表3 12例實際樣品中檢出的農(nóng)藥及定量結(jié)果Table 3 Detection results of pesticides in 12 samples

2.8 實際樣品的分析

隨機抽取本地區(qū)12例市售水果樣品，包括柚子、菠蘿、橙、山楂各3例，采用本方法進行測定。樣品檢出聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、丙溴磷、噠螨靈4種農(nóng)藥，共9頻次，其中丙溴磷、噠螨靈的檢出頻次較高，測定結(jié)果見表3，部分陽性樣品的MRM圖見圖3。

3 結(jié) 論

本文以柚子等4種高酸水果基質(zhì)作為實驗對象，通過優(yōu)化提取和SPE凈化條件，建立了GC-MS/MS測定48種農(nóng)藥殘留的分析方法。該方法適用性廣、定量準確，檢出限能夠滿足GB 2763-2016的要求，可應用于高酸水果基質(zhì)中痕量農(nóng)藥殘留的檢測。

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