恩度聯(lián)合紫杉醇對(duì)C57BL/6肺癌小鼠腫瘤生長及CA Ⅸ、HIF-1α表達(dá)的影響

趙 娜，羅孟亞男

0 引言

肺癌是惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一[1]，全世界每年新增的肺癌病例大約120萬，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康和生命安全。目前臨床上常用的治療肺癌的方法有化學(xué)治療、放射治療和外科手術(shù)治療，化療和放療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)殺死對(duì)機(jī)體有益的細(xì)胞，不良反應(yīng)較多，包括放射性食管炎和放射性肺炎[2]；手術(shù)治療主要適用于肺癌早期患者，而且肺癌根治術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)率在80%左右，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高于局部復(fù)發(fā)率[3]。因此，采用安全有效的藥物治療肺癌成為研究的熱點(diǎn)問題，植物來源的藥物已經(jīng)普遍應(yīng)用于癌癥治療中，而紫杉醇是目前最有前景的植物抗癌藥物，與其他抗癌藥物相比具有抗癌范圍廣、藥物效應(yīng)強(qiáng)的特點(diǎn)。本試驗(yàn)旨在研究紫杉醇在肺癌治療中的優(yōu)勢和療效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 具有高自發(fā)肺轉(zhuǎn)移潛能的Lewis肺癌瘤株，移植100%，來源:國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)(China Infrastructure of Cell Line Resource)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6近交系小鼠，7～8周齡，體重23～25 g，雌雄各半，購自第一軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心(合格證號(hào):P7A03)。

1.1.3 主要試劑與儀器 恩度(15 mg/支，國藥準(zhǔn)字S20050088，山東先聲麥得津生物制藥有限公司)；紫杉醇(30 mg/支，國藥準(zhǔn)字H20053837，安徽大東方藥業(yè)有限責(zé)任公司)；DAB顯色試劑盒均購自北京中杉公司；免疫組化試劑盒購于福州邁新公司；小鼠缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)和碳酸酐酶Ⅸ(CA Ⅸ)ELISA試劑盒購自英國Abcam科技有限公司；電子天平購自美國Thermo Fisher Scientific公司；光學(xué)顯微鏡和顯微攝像儀購自日本Olympus公司；3K15超低溫離心機(jī)購自德國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6小鼠肺癌造模 將購買的小鼠Lewis肺癌細(xì)胞解凍、復(fù)蘇，取0.2 ml貼壁生長的對(duì)數(shù)期(細(xì)胞數(shù)為1×107/ml)的Lewis肺癌細(xì)胞接種于C57BL/6小鼠右腋下，接種后第21天，選取精神和食欲良好的小鼠進(jìn)行脫頸椎處死，取出生長良好的無破潰的腫瘤組織進(jìn)行體內(nèi)傳代：取完整的瘤組織，去除包膜后，選取魚肉狀組織制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×107/ml，將癌細(xì)胞懸液分別接種于5組小鼠右腋下，0.2 ml/只。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將300只C57BL/6肺癌小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法平均分成5組，每組60只，雌雄各半，分別命名為空白對(duì)照組、正常對(duì)照組、紫杉醇低劑量組、紫杉醇中劑量組和紫杉醇高劑量組，正常對(duì)照組注射7.5 mg/m2恩度進(jìn)行治療，空白對(duì)照組注射等量容積生理鹽水，紫杉醇低劑量組、紫杉醇中劑量組和紫杉醇高劑量組在正常對(duì)照組的基礎(chǔ)上分別注射30、100、170 mg/m2紫杉醇進(jìn)行治療。治療時(shí)間為4周。

1.2.3 觀察指標(biāo) ①肺癌細(xì)胞移植前記錄5組小鼠的體重；②測量治療過程中小鼠腫瘤的生長情況：給藥第4、10、16、22、28天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最大徑(a)及最小徑(b)，計(jì)算腫瘤的體積(V)，V=ab2/2，繪制腫瘤生長曲線；③記錄5組小鼠的瘤重及抑瘤率：持續(xù)治療4周后將小鼠脫頸椎處死，將腫瘤組織剝離出來，記錄腫瘤組織的重量及抑瘤率，抑瘤率(%)=[對(duì)照組平均瘤重(g)-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重(g)]/對(duì)照組平均瘤重(g)×100%。

1.2.4 免疫組化檢測CA Ⅸ、HIF-1α的表達(dá)水平及結(jié)果判定 持續(xù)治療4周后，選取生長良好的腫瘤組織制作石蠟切片(厚度不超過5 mm)，將組織切片在92～98 ℃條件下存放20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清用來中和非特異性反應(yīng)后，在組織玻片上分別滴加CA Ⅸ和HIF-1α一抗，于4 ℃過夜放置，復(fù)溫后在組織玻片上滴加二抗。使用DAB顯色試劑進(jìn)行底物顯色，當(dāng)呈現(xiàn)金黃色時(shí)終止顯色反應(yīng)，使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染后，用奧林帕斯CCD攝像機(jī)隨機(jī)采集5個(gè)視野(400×)的圖片，觀察CA Ⅸ和HIF-1α蛋白在癌細(xì)胞胞核和(或)胞質(zhì)的表達(dá)情況。

1.2.5 ELISA檢測CA Ⅸ、HIF-1α的表達(dá)水平 持續(xù)治療4周后，各組分別取5只小鼠眼眶靜脈血，采用CA Ⅸ、HIF-1α ELISA試劑盒檢測移植瘤小鼠血清中CA Ⅸ、HIF-1α的表達(dá)水平。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 五組小鼠體重比較 治療前，五組小鼠的體重相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 五組小鼠移植瘤體積的變化情況 從治療后第10天開始，其他各組的腫瘤體積小于空白對(duì)照組(P<0.05)，紫杉醇組的腫瘤體積小于正常對(duì)照組(P<0.05)，紫杉醇中劑量和紫杉醇高劑量組的腫瘤體積小于紫杉醇低劑量組(P<0.05)，紫杉醇高劑量組的腫瘤體積小于紫杉醇中劑量組(P<0.05)。結(jié)果見圖1、表2。

表1 五組小鼠體重的比較

圖1 五組小鼠移植瘤體積的變化情況

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與正常對(duì)照組比較，#P<0.05；與紫杉醇低劑量組比較，@P<0.05；與紫杉醇中劑量組比較，&P<0.05

2.3 五組小鼠瘤重及抑瘤率的比較 持續(xù)治療4周后，其他各組的瘤重低于空白對(duì)照組(P<0.05)，紫杉醇組的瘤重低于正常對(duì)照組(P<0.05)，紫杉醇中劑量組和紫杉醇高劑量組的瘤重低于紫杉醇低劑量組(P<0.05)，紫杉醇高劑量組的瘤重低于紫杉醇中劑量組(P<0.05)。

紫杉醇組的抑瘤率高于正常對(duì)照組，且隨著紫杉醇劑量增加，對(duì)腫瘤生長的抑制明顯增加。見表3。

2.4 五組小鼠肺癌組織中CA Ⅸ、HIF-1α表達(dá)情況比較 持續(xù)治療4周后，五組小鼠肺癌組織中CA Ⅸ、HIF-1α表達(dá)情況如圖2、圖3所示，與空白對(duì)照組和正常對(duì)照組比較，紫杉醇低劑量組、紫杉

醇中劑量組和紫杉醇高劑量組小鼠肺癌組織中CA Ⅸ、HIF-1α表達(dá)水平明顯降低。

2.5 ELISA檢測五組小鼠血清中CA Ⅸ、HIF-1α表達(dá)情況 持續(xù)治療4周后，其他各組小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α的表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)；紫杉醇治療組小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)；紫杉醇中劑量組和紫杉醇高劑量組小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α表達(dá)水平顯著低于紫杉醇低劑量組(P<0.05)，紫杉醇高劑量組小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α表達(dá)水平顯著高于紫杉醇中劑量組(P<0.05)。見表4。

3 討論

恩度是一種血管內(nèi)皮抑制素，能通過抑制腫瘤新生血管的生成達(dá)到抑制腫瘤的目的，雖然恩度在大多數(shù)癌癥的治療中取得了一定效果，但其可導(dǎo)致相關(guān)毒副作用，如心血管毒性、肌肉關(guān)節(jié)疼痛、胃腸反應(yīng)、肝臟毒性及皮膚過敏反應(yīng)等。從臨床用藥情況來看，植物抗癌藥物已普遍應(yīng)用于癌癥治療中，其中應(yīng)用最廣泛的植物抗癌藥物是天然植物堿[4]。

紫杉醇(Paclitaxel，商品名：Taxol)是從紅豆杉屬植物中提取的一種天然的植物堿，其有效成分是紫杉烷類二萜化合物，是近年來備受關(guān)注的抗癌藥物之一。紫杉醇在低濃度下(0.25 μm)即催化微管蛋白的迅速合成，這些微管使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂期的G2和M期，阻斷了細(xì)胞的正常分裂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5-6]。紫杉醇在臨床癌癥治療上取得了顯著效果，申維喜等[7]研究表明，體外環(huán)境下紫杉醇可誘導(dǎo)Her-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴關(guān)系。婁源杰等[8-9]采用恩度聯(lián)合紫杉醇治療非小細(xì)胞肺癌，結(jié)果表明，恩度聯(lián)合紫杉醇能有效抑制腫瘤的生長、療效較好；周風(fēng)舉等[10]研究表明，紫杉醇聯(lián)合氟尿嘧啶類化療藥對(duì)腹膜轉(zhuǎn)移胃癌有顯著療效；林錦源等[11]研究表明，紫杉醇單藥治療胃癌的有效率約為20%。本研究結(jié)果表明，紫杉醇組的腫瘤體積顯著小于空白對(duì)照組和正常對(duì)照組，且呈劑量依賴型；持續(xù)治療4周后，紫杉醇組的瘤重顯著小于空白對(duì)照組和正常對(duì)照組，紫杉醇組的抑瘤率明顯高于空白對(duì)照組和正常對(duì)照組，且隨著紫杉醇劑量增加，抑瘤率明顯升高。結(jié)果表明，紫杉醇能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長。

表2 五組小鼠移植瘤體積的變化情況(mm3)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與正常對(duì)照組比較，#P<0.05；與紫杉醇低劑量組比較，@P<0.05；與紫杉醇中劑量組比較，&P<0.05

表3 五組小鼠瘤重、抑瘤率比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與正常對(duì)照組比較，#P<0.05；與紫杉醇低劑量組比較，@P<0.05；與紫杉醇中劑量組比較，&P<0.05

表4 五組小鼠血清中CA Ⅸ、HIF-1α 的表達(dá)水平(pg/ml)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與正常對(duì)照組比較，#P<0.05；與紫杉醇低劑量組比較，@P<0.05；與紫杉醇中劑量組比較，&P<0.05

圖2 五組小鼠肺癌組織中CA Ⅸ的表達(dá)情況(400×)

圖3 五組小鼠肺癌組織中HIF-1α的表達(dá)情況(200×)

HIF-1α最先由Semenza等[12]發(fā)現(xiàn)，與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及患者存活有關(guān)[13-14]。研究表明，HIF-1α能夠調(diào)控一系列基因表達(dá)介導(dǎo)組織細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)性，從而維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新生血管生成，促進(jìn)增殖及轉(zhuǎn)移，同時(shí)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性[15]。目前，研究者已在多種惡性腫瘤中檢測到HIF-1α蛋白的過度表達(dá)，如卵巢癌[15]、腎細(xì)胞癌[16]、前列腺癌[17]等。CA Ⅸ位于VLH腫瘤抑制基因的下游，由HIF-1α途徑激活[17]，在正常人體組織中表達(dá)較低，但在許多腫瘤如腎細(xì)胞癌[16]、前列腺癌[17]和肺癌中表達(dá)明顯增強(qiáng)，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[18]。

本研究結(jié)果表明，紫杉醇組小鼠組織和血清中CA Ⅸ和HIF-1α的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組；且隨著紫杉醇劑量增加，CA Ⅸ和HIF-1α的表達(dá)水平顯著降低。結(jié)果表明，紫杉醇能夠有效降低腫瘤細(xì)胞中CA Ⅸ和HIF-1α 的表達(dá)水平，推測紫杉醇是通過抑制腫瘤細(xì)胞生長來調(diào)控CA Ⅸ和HIF-1α 表達(dá)。

綜上所述，恩度聯(lián)合紫杉醇治療C57BL/6小鼠肺癌能顯著控制腫瘤的生長，降低CA Ⅸ和HIF-1α的表達(dá)水平，為肺癌的臨床治療提供一定的參考依據(jù)。

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