巢氏PCR檢測血片中低密度間日瘧原蟲的研究*

尚婧曄 郁濤 鄒晏 李黎 劉陽

(四川省疾病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041)

瘧疾是嚴(yán)重危害人類身體健康和生命安全，影響流行區(qū)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的全球性重要蟲媒傳染病[1-3]。四川省曾經(jīng)是全國瘧疾疫情最嚴(yán)重的地區(qū)之一，最高感染率達(dá)87.4/萬，發(fā)病人數(shù)一度超過50多萬[4-5]。建國以來，經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的努力，四川省瘧疾防治工作取得了顯著成效，流行范圍逐步減小，人群發(fā)病率逐漸降低，2010年全省瘧疾防治工作正式進(jìn)入消除階段，自2011年起已連續(xù)7年無本地感染病例報(bào)道[5-8]。盡管如此，瘧疾仍然是目前四川省最重要的公共衛(wèi)生問題之一。近年來，隨著赴境外務(wù)工人數(shù)的不斷增加，輸入性瘧疾病例數(shù)不斷增加，并持續(xù)出現(xiàn)死亡病例，輸入性瘧疾形勢異常嚴(yán)峻[8]。在現(xiàn)階段新發(fā)病例少、感染程度低、用藥普遍、輸入性為主的防控新形勢下，如何提升早期、藥后低密度瘧原蟲檢測能力，實(shí)現(xiàn)及時(shí)診斷，準(zhǔn)確鑒別本地、輸入、變異病例，控制繼發(fā)性感染，防止疫情爆發(fā)，是目前瘧疾防控面臨的重要難題。

本研究以人工模擬制成不同濃度梯度的間日瘧原蟲血片，通過優(yōu)化DNA提取前處理方法，結(jié)合巢式PCR擴(kuò)增，測定其最低檢出限，探索巢式PCR用于低密度瘧原蟲血片DNA檢測的可行性，為瘧疾低度感染病例提供行之有效的早期診斷方法，并為下一步探索區(qū)分本地流行與輸入性、變異性瘧疾提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及試劑、設(shè)備 感染性血液樣本保存于四川省疾病預(yù)防控制中心瘧疾診斷參比實(shí)驗(yàn)室，來源為1例2014年廣安市岳池縣間日瘧死亡病例，經(jīng)四川省疾控中心專家鏡檢、PCR復(fù)核，確認(rèn)為高密度間日瘧原蟲感染血樣。稀釋用血樣保存于四川省疾控中心門診，來源為健康人抗凝血。DNA抽提試劑盒(QIAamp DNAMini Kit)購自德國Qiagen公司，2×Power Taq PCR Master Mix以及引物購自成都擎科生物技術(shù)有限公司，DNA標(biāo)志物購自寶生物工程(大連)有限公司，核酸染料購自北京索萊寶科技有限公司，瓊脂糖購自西班牙Biowest公司，甲醇、無水乙醇和二甲苯購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，吉氏色素購自成都市科龍化工試劑廠，2.58%的吉氏染料自制備用。DNA自動(dòng)提取采用Qiagen核酸純化儀QIAcube。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度梯度間日瘧原蟲血片的制備 將具有較高密度的原始間日瘧原蟲抗凝血血樣常溫放置溶解，觀測無血凝塊后，采用健康人抗凝血作為稀釋液，按照1：10、1：100、1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000對(duì)原濃度血樣進(jìn)行稀釋，制成9個(gè)濃度梯度血樣。每個(gè)濃度同時(shí)制作2張標(biāo)準(zhǔn)血片，厚血膜、薄血膜分別以5ul、2ul進(jìn)行定量制作，采用吉氏染色法染色。原樣標(biāo)準(zhǔn)血片標(biāo)記為O，其余血樣片按照稀釋度的增加依次標(biāo)記為A、B、C、D、E、H。

1.2.2 血片鏡檢 每張血片同時(shí)由兩名具有豐富經(jīng)驗(yàn)的瘧原蟲鏡檢專家進(jìn)行顯微鏡觀察，確定每一濃度所有血片的鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果。鏡檢計(jì)數(shù)方法采用由WHO推薦的白細(xì)胞瘧原蟲計(jì)算公式：瘧原蟲數(shù)÷白細(xì)胞數(shù)×每uL血中白細(xì)胞數(shù)= 瘧原蟲數(shù)/uL血。此計(jì)算公式若用于無法進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)的樣本，則以國際標(biāo)準(zhǔn)按8000個(gè)/mL血白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算。厚血膜檢查200個(gè)油鏡視野，若未發(fā)現(xiàn)瘧原蟲則記為陰性[9]，當(dāng)某一濃度2張血片都為陰性時(shí),該濃度的上一濃度即作為間日瘧瘧原蟲的顯微鏡檢出限。

1.2.3 DNA提取

1.2.3.1 所有濃度血片在鏡檢后進(jìn)行一次簡單的脫片晾干。

1.2.3.2 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]，采用DNA試劑盒改良法，在厚血膜表面滴1～2滴預(yù)熱的ATL裂解液，用無菌手術(shù)刀片將整個(gè)血膜刮下，使其全部與ATL液混合后加入無菌2 ml EP管底。薄血膜直接采用無菌手術(shù)刀片緩慢刮取，最后滴上ATL裂解液混合加入EP管底。

1.2.3.3 所有樣本漩渦震蕩10s，8000×g離心l min，加入適量ATL裂解液，85℃孵育10min。根據(jù)DNA抽提試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)操作步驟設(shè)置程序，將樣本放入核酸自動(dòng)提取儀中進(jìn)行DNA自動(dòng)提取。

1.2.4 巢式PCR擴(kuò)增

1.2.4.1 參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物[11-12](根據(jù)瘧原蟲SSU rRNA基因保守區(qū)所設(shè)計(jì)的PCR引物)進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增。rPLU5和rPLU6為瘧原蟲屬特異性引物，RVIV為間日瘧原蟲(P. vivax)種特異性引物。引物由成都擎科生物科技有限公司合成，具體引物序列和預(yù)期片段長度,見表1。

表1 瘧原蟲特異性引物 Table 1 Specific primers

1.2.4.2 反應(yīng)體系 2 ×Master Mix 10μl， 上、下游引物(10 μmol/L) 各1μl， DNA模板2μl，ddH2O6μl，總反應(yīng)體積20μl。

1.2.4.3 反應(yīng)條件 第1 輪94 ℃3 min； 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃90 s， 共34個(gè)循環(huán)， 72 ℃ 5 min。第2輪94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 60 s， 共34個(gè)循環(huán)， 72 ℃5 min。

1.3 電泳檢測 取10μl第2輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 測序比對(duì) 第2輪PCR產(chǎn)物送往成都擎科生物有限公司測序，結(jié)果上傳NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 血片鏡檢 由2名具有豐富經(jīng)驗(yàn)的瘧原蟲鏡檢專家鏡下觀察計(jì)數(shù)，在第3個(gè)稀釋度后鏡檢結(jié)果均為陰性，即1:100為瘧原蟲血片的顯微鏡檢出限,見表2。

表2 不同濃度梯度檢出限匯總表 Table 2 The detection threshold for P. vivax

2.2 巢式PCR擴(kuò)增 經(jīng)過巢氏PCR擴(kuò)增、瓊脂糖電泳，瘧原蟲血片薄血膜、厚血膜分別在第3個(gè)和第8個(gè)稀釋度后檢出均為陰性，即瘧原蟲血片薄血膜檢出限為1:100，厚血膜檢出限1:16000，見圖1、表2。

2.3 測序和序列比對(duì)結(jié)果 第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序、blast比對(duì)，結(jié)果顯示產(chǎn)物序列與GenBank中已登記的間日瘧原蟲參考序列一致性為100%，見圖2。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 Figure 1 PCR results

注：1-1：薄血膜提取DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果；1-2：厚血膜提取DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果。O：原樣； A：1：10稀釋度；B：1：100稀釋度；C：1：1000稀釋度；D：1：2000稀釋度；E：1：4000稀釋度；F：1：8000稀釋度；G：1：16000稀釋度；H：1：32000稀釋度；M：DNA標(biāo)志物；NTC：無模板對(duì)照；PC：陽性對(duì)照

圖2 核酸序列比對(duì)圖 Figure 2 The alignment of nucleotide sequence

3 討論

近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以巢式PCR為代表的分子生物學(xué)方法開始逐漸被應(yīng)用于瘧疾的實(shí)驗(yàn)室檢測中[13-17]。盡管顯微鏡下觀察、鑒別、計(jì)數(shù)作為病原學(xué)的經(jīng)典方法目前仍被視為金標(biāo)準(zhǔn)廣泛應(yīng)用于瘧疾診斷，但在當(dāng)下已進(jìn)入瘧疾消除階段，流行程度普遍較低，感染程度往往較輕的情況下，對(duì)于早期僅含有較低密度病原的無癥狀或癥狀較輕的患者，以及已服用抗瘧藥物的患者，若僅采用顯微鏡觀察，顯然具有較大的局限性，難以進(jìn)行及時(shí)診斷并實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒別，極易造成漏診。本次研究結(jié)果表明，巢式PCR檢測間日瘧原蟲血片厚血膜提取DNA的檢出限為0.8個(gè)蟲/μl血，符合此前Scopel等[18]的報(bào)道結(jié)果——厚血膜中瘧原蟲密度小于20個(gè)/μl時(shí)，巢式PCR依然能夠擴(kuò)增出陽性條帶——相較之下本次檢出靈敏度更高，更遠(yuǎn)低于顯微鏡檢出限132個(gè)/ul血。薄血膜DNA的提取與擴(kuò)增效果相對(duì)較差，其檢出限與鏡下檢查水平一致，這可能與薄血膜涂制血量少，涂布面大而導(dǎo)致血片刮取樣本耗損多，以及血片鏡檢后進(jìn)行過一次脫片有關(guān)?？偟膩碚f，相較于鏡下觀察，基于DNA提取的巢式PCR技術(shù)作為顯微鏡檢查的有效補(bǔ)充方法之一，靈敏度顯著提升，對(duì)于低密度瘧原蟲感染診斷具有較高的應(yīng)用意義。

PCR的擴(kuò)增效果取決于多種因素，其中從樣本中提取到的DNA濃度和質(zhì)量是決定PCR成功與否及其檢出靈敏度的關(guān)鍵因素。李軻[19]等報(bào)道以血樣直接提取DNA為樣本進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，最低可檢出達(dá)到0.0856個(gè)蟲/ul血，檢出靈敏度相較于以血片為載體、從血膜中提取DNA為樣本的本次研究結(jié)果高出近一個(gè)數(shù)量級(jí)，其原因一方面在于全血樣本可用于提取DNA的血樣量大，提取病原總量較多(同等密度下)，另一方面可能與血片取膜時(shí)具有一定損耗有關(guān)。盡管全血樣用于瘧原蟲DNA的提取效果較佳，尤其是在病原密度較低的情況下，但其運(yùn)輸條件相對(duì)復(fù)雜，且無法長期保存，難以滿足現(xiàn)階段瘧疾多項(xiàng)目檢測并行的需求。血片作為瘧疾樣本檢測、保存最主要、最常見的載體之一，具有制作所需血量小、價(jià)格低廉、可長久保存的特點(diǎn)，長期以來被廣泛應(yīng)用于各級(jí)檢測機(jī)構(gòu)，也是多數(shù)早期瘧疾病人現(xiàn)有留存的唯一樣本證據(jù)。從血片中提取瘧原蟲DNA具有較大的困難性，尤其是對(duì)于年代已久的陳舊血片，因早年制作不規(guī)范，保存條件不當(dāng)，加上經(jīng)過染色、反復(fù)洗脫、復(fù)染而導(dǎo)致留存瘧原蟲處于較低密度狀態(tài)[20]。本次研究結(jié)果顯示，通過改進(jìn)前處理方法結(jié)合巢式PCR擴(kuò)增可從血片中成功檢出瘧原蟲，尤其是厚血膜，在較低密度下仍可獲得較高質(zhì)量的核酸，證實(shí)了血片應(yīng)用于瘧疾的分子生物學(xué)檢測的可行性，為提取陳舊性血片中瘧原蟲DNA用于回顧性研究不同階段瘧疾防治進(jìn)程中瘧原蟲基因型和多態(tài)性變化，以實(shí)現(xiàn)病例來源(本地、輸入、變異)追溯提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本次研究結(jié)果也提示我們，在血片薄血膜的DNA提取方法上還有待進(jìn)一步的探索和提高，嘗試耗損更小、精確度更高的DNA提取方法。

值得注意的是，盡管制成的血片可以固定瘧原蟲蟲體，但在其長期保存與反復(fù)用于鏡檢的過程中，仍然存在部分蟲體發(fā)生變形、裂解，在鏡下難以識(shí)別辨認(rèn)的可能，造成鏡檢計(jì)數(shù)低于實(shí)際感染水平的情況，而類似狀況在在現(xiàn)實(shí)工作中實(shí)際普遍存在。不同于依賴形態(tài)鑒別為手段的顯微鏡檢查，以DNA為模板的PCR方法更為穩(wěn)定，因?yàn)镈NA在蟲體裂解后仍可長期存在，形態(tài)是否完整對(duì)其擴(kuò)增并不具有太大影響，這也是造成分子生物學(xué)檢測靈敏度遠(yuǎn)高于鏡檢的重要原因之一。為準(zhǔn)確、定量反應(yīng)血片樣本尤其是陳舊性血片樣本中瘧原蟲載量，比較顯微鏡鏡下計(jì)數(shù)與實(shí)際感染水平、巢式PCR與其它不同分子生物學(xué)方法檢測能力的差異大小，并進(jìn)一步提升瘧原蟲血片中病原DNA的檢測靈敏度，本課題組后續(xù)將進(jìn)一步采用qPCR方法進(jìn)行相關(guān)檢測，以期獲得更為全面、準(zhǔn)確的比對(duì)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

研究結(jié)果顯示，血片作為常規(guī)檢測和保存載體，可有效應(yīng)用于瘧原蟲DNA的提取，結(jié)合巢氏PCR擴(kuò)增，獲得顯著高于顯微鏡的檢測水平，尤其是厚血膜檢出限達(dá)到0.8個(gè)蟲/μl血，提示以高質(zhì)量DNA提取為基礎(chǔ)的巢氏PCR方法更適宜于作為檢測低密度感染瘧疾的有效手段。

【參考文獻(xiàn)】

[1]World Health Organization. World malaria report 2010[M]. Geneva: WHO Press, 2010.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局.瘧疾防治手冊[M]. 第3版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2007: 256-263.

[3]高琪. 我國消除瘧疾面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)[J]. 中國血吸蟲病防治雜志,2011, 23(04): 347-349.

[4]吳先萍,許國君,康楊, 等. 四川省輸入性瘧疾現(xiàn)況與特征[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2009, 36(24): 4667-4669.

[5]許國君,李黎,郁濤, 等. 四川省瘧疾流行態(tài)勢與消除瘧疾進(jìn)展[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志, 2014, 30(09): 783-787.

[6]李黎,劉陽,許國君, 等. 2012-2014年四川省瘧疾疫情分析[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2016, 28(04): 397-400.

[7]李黎, 許國君, 郁濤, 等. 2011年-2013年四川省輸入性瘧疾疫情與診治情況分析[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志, 2015, 31(6): 471-475.

[8]李黎, 劉陽, 許國君, 等. 四川省2015年輸入性瘧疾流行病學(xué)特征分析[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2017, 35(01): 75-79.

[9]瘧原蟲鏡檢手冊[M]. 成都: 四川科學(xué)技術(shù)出版社, 1990. 37.

[10] 徐超, 魏慶寬, 李瑾, 等. 提取陳舊陽性血膜瘧原蟲DNA方法的研究[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2015, 33(5): 372-376.

[11] 李靜宜, 齊志群, 薛燕萍, 等. Chelex法從惡性瘧原蟲薄血涂片提取 DNA 的基因診斷[J].中華傳染病雜志, 2008, 26( 5): 372-376.

[12] Snounou G, Viriyakosol S, Zhu XP,etal. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction[J]. Mol Biochem Parasitol, 1993, 61(2): 315-320.

[13] 武松, 黃芳, 張國慶, 等. 巢氏PCR判定西藏瘧疾流行區(qū)傳瘧媒介[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2010, 26(07): 648-650，653.

[14] 周瑞敏,劉穎,錢丹, 等. 2012年河南省瘧疾標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測分析[J]. 中國病原生物學(xué)雜志,2014,9(02):177-179.

[15] 田斌, 段績輝, 徐明忠, 等. 三例輸入性卵形瘧的實(shí)驗(yàn)室診斷[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2014, 29(08): 851-855.

[16] 周瑞敏, 張紅衛(wèi), 鄧艷, 等. 2例輸入性卵形瘧的實(shí)驗(yàn)室檢測[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2013, 31(02): 127-130.

[17] 陳玉鳳, 紀(jì)穎, 肖冰. 2015年大連市瘧疾病例實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果分析[J]. 微量元素與健康研究, 2016, 33(6): 67-68.

[18] Scopel KKG, Fontes CJF, Nunes C,etal. Low sensitivity of nested PCR using Plasmodium DNA extracted from stained thick blood smears: an epidemiological retrospective study among subjects with low parasitaemia in an endemic area of the Brazilian Amazon region[J]. Malaria J, 2004, 3(1): 8.

[19] 李軻, 周水森, 黃芳, 等. 3種PCR方法檢測低密度惡性瘧原蟲血癥的比較研究[J]. 中國病原生物學(xué)雜志, 2013, 8(04): 331-335.

[20] Kimura M, Kaneko O, Inoue A,etal. Amplification by polymerase chain reaction of Plasmodium falciparum DNA from Giemsa-stained thin blood smears[J]. Mol Biochem Parasitol, 1995, 70 (1):193-197.