高效液相色譜法檢測生物體內(nèi)羥基喜樹堿的方法學(xué)研究*

★ 雙若男 平欲暉*

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004)

羥基喜樹堿屬植物來源類一種天然抗癌藥，具有活性高、抗瘤譜廣等特點，它對肝癌、宮頸癌、胃癌、直腸癌等均有很好的效果[1-2]。高效液相色譜法(HPLC)可對藥物進(jìn)行定量定性的檢測，且具有選擇性好、靈敏性高的特點。本文采用高效液相色譜法檢測羥基喜樹堿在生物基質(zhì)中的含量，并依據(jù)《中國藥典》第四部9012生物樣品定置分析方法驗證的指導(dǎo)原則對方法的特異性、線性與范圍、定量限、精確度與回收率等進(jìn)行驗證[3-4]。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高，回收率及穩(wěn)定性好。結(jié)論HPLC方法能夠高效檢測生物基質(zhì)中羥基喜樹堿的含量。

1 儀器與試劑

電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；waters液相色譜儀(蘇州市萊特科學(xué)儀器有限公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電動離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；渦旋儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

甲醇(西隴科學(xué)股份有限公司，色譜純)；三氯甲烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；磷酸二氫鉀(天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司)；羥基喜樹堿(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)；喜樹堿(陜西冠捷科技有限公司)；膽固醇(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司)；大豆卵磷脂(沈陽天峰生物制藥有限公司)；肝素鈉(上海藍(lán)季生物)；生理鹽水(江西科倫藥業(yè)有限公司)。

2 血漿及各組織中羥基喜樹堿(HCPT)含量測定方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制及生物樣品的前處理

2.1.1 儲備液的配制 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取羥基喜樹堿粉末2.417mg置于25mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解定容至刻度，使成0.09668mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。儲存于-4 ℃冰箱中，需要時采用甲醇稀釋即可。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：以喜樹堿為內(nèi)標(biāo)，精密稱取喜樹堿粉末1.07mg置于10mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解并定容至刻度，使成0.0107mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。儲存于-4 ℃冰箱中，需要時采用甲醇稀釋即可。

NaOH(pH=12)溶液的配制：精密稱取NaOH固體0.4g,蒸餾水溶解后置于1000mL的容量瓶，定容至刻度即得。

0.1mol/mL的NaOH溶液的配制：精密稱取NaOH固體4g,蒸餾水溶解后置于1000mL的容量瓶，定容至刻度即得。

PBS(pH=6.5)緩沖液的配制：精密稱取磷酸二氫鉀6.8g置于1000mL的容量瓶，加入0.1mol·mL-1的NaOH溶液152mL，用蒸餾水定容至刻度即得。

2.1.2 血漿樣品和組織樣品的前處理 血漿的處理：眼眶取血置于加有1 %肝素鈉離心管中，渦旋30 s，以13000 r/min離心10min，取上清液0.2mL，加甲醇0.8mL沉淀蛋白，渦旋30s，13000 r/min離心10min，取上清液待分析。

組織的處理：取心，肝，脾，肺，腎用生理鹽水漂洗殘留血，濾紙吸干水分，精密稱定每一臟器組織的質(zhì)量，用生理鹽水制備成1∶2的各組織勻漿，渦旋30s，13000r/min離心10min，，取上清液0.2mL，加甲醇0.8mL沉淀蛋白，渦旋30s，超聲3min，13000r/min離心10min，取上清液待分析。

2.1.3 羥基喜樹堿脂質(zhì)體的制備 薄膜分散-超聲法：稱取處方量的HCPT、TET、大豆卵磷脂、膽固醇溶于氯仿中，置于500mL圓底燒瓶，50℃、800mbar 減壓蒸發(fā)，90r·min-1旋轉(zhuǎn)成膜，于40℃真空干燥箱干燥過夜，加入pH6.5 的磷酸鹽緩沖液10mL，置60℃水浴中水化2.5h，取出后探頭超聲。

2.2 色譜條件 色譜柱：SinoChrom ODS-BP (250mm×4.6mm,5μm) 流動相：甲醇：水(50∶50) 柱溫：25℃ 檢測波長：380nm 進(jìn)樣量：10μL流速：1mL·min-1。

2.3 特異性 取6個不同來源小鼠的空白血漿和各組織(心，肝，脾，肺，腎)按照2.1.2的“血漿樣品和組織樣品的前處理”得到空白血漿和空白組織樣品圖；在空白血漿添加羥基喜樹堿和喜樹堿的標(biāo)準(zhǔn)液同法操作得到色譜圖；小鼠尾靜脈后的實際血漿色譜圖。將三種操作的色譜圖進(jìn)行比較觀察基質(zhì)中內(nèi)源性組分或樣品中其他組分對代謝物的測量是否存在影響。

通過對生物樣品基質(zhì)中羥基喜樹堿特異性的考察，得到HPLC色譜圖，羥基喜樹堿的出峰時間約11min，內(nèi)標(biāo)物喜樹堿的出峰時間約16min。從圖1中可以看出待測物及內(nèi)標(biāo)在其保留時間下空白血漿和各空白組織中內(nèi)源性物質(zhì)對待測成分及內(nèi)標(biāo)無明顯干擾，可以忽略，且待測物和內(nèi)標(biāo)可以較好的分離，因此該方法具有很好的特異性。

2.4 線性范圍與定量下限 精密量取羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇超聲溶解，并分別加入等量內(nèi)標(biāo)，定容至刻度線，振搖混勻，得含羥基喜樹堿1.010、2.010、5.030、10.05、20.11、 50.27g/mL的溶液。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，加入空白血漿和空白組織液100μL，按照"2.1.2"項下處理，用上述色譜條件進(jìn)行測定，以羥基喜樹堿峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比對濃度進(jìn)行線性回歸。取空白血漿或組織勻漿，加入一定量HCPT對照品，得到4μg·L-1樣品，處理后，測定其峰高與噪音，以信燥比大于或等于10計算羥基喜樹堿的最低定量限。

結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)在0.9957～0.9987之間，線性結(jié)果如表1。以信噪比大于或等于10計算，本法羥基喜樹堿在血漿、心、肝、脾、肺、腎中的最低檢測質(zhì)量濃度分別為0.00202、0.00202、0.00404、0.00606、0.00404、0.00404μg·mL-1，其可以檢測分析物的藥代動力學(xué)研究。

2.5 方法與系統(tǒng)精密度 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中選取高，中，低3個差異濃度。即選取濃度為50.27、20.11、1.01g/mL為質(zhì)控樣品。按“ 2.1.2”項下樣品前處理方法，并加入內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行測定，1d內(nèi)連續(xù)測定5次，計算日內(nèi)RSD；連續(xù)測定5d，每天連續(xù)測定2次，計算日間RSD。

質(zhì)控樣品的日內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果見表2。質(zhì)控樣品的日內(nèi)精密度RSD在1.816%～4.4104%之間。日間精密度RSD在0.3%～12.38% 范圍內(nèi)。結(jié)果顯示日內(nèi)日間精密度均在可接受標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)，可以用于空白血漿和空白組織中的分析物的準(zhǔn)確測定。

(A)空白血漿和各空白組織；(B)空白血漿和空白組織添加分析物和內(nèi)標(biāo)(C)給藥10min后的實測血漿樣品和各組織樣品；1羥基喜樹堿；2喜樹堿

分析物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)(r)線性范圍(μg/mL)心y=0.0489x+0.10110.99701.010-50.27肝y= 0.2107x- 0.18330.99571.010-50.27脾y= 0.1676x+ 0.55980.97801.010-50.27肺y= 0.1741x+ 0.090.99761.010-50.27腎y= 0.2063x+ 0.18580.99871.010-50.27血y= 0.2142x+ 0.22730.99781.010-50.27

2.6 回收率

2.6.1 提取回收率 取質(zhì)控樣品按“ 2.1.2”項下樣品預(yù)處理方法，每個濃度配制5份樣品并加入內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)樣分析，求得待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比。另取相同濃度的質(zhì)控藥品，不經(jīng)處理，加入相同體積的內(nèi)標(biāo)。比較提取以后分析物的色譜峰面積與未經(jīng)提取直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積，考察羥基喜樹堿的提取率。

2.6.2 方法回收率 取質(zhì)控樣品按“ 2.1.2”項下樣品預(yù)處理方法，每個濃度配制5份樣品并加入內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)樣分析，將HCPT峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積之比代入回歸方程，得HCPT測定濃度，以測定濃度與配制濃度之比計算方法回收率。

質(zhì)控樣品3種濃度的血漿和組織樣品中HCPT的回收率結(jié)果見表3。

表2 分析物在空白血漿和各空白組織中的精密度(n=10)

表3 分析物在空白血漿和各空白組織中的提取 回收率和方法回收率(n=5)

2.7 穩(wěn)定性 配置5份低、中、高各個濃度的質(zhì)控樣品。短期穩(wěn)定性操作是將未經(jīng)處理的質(zhì)控樣品在室溫下存放4 h后再去處理檢測。凍融穩(wěn)定性操作是將處理后的質(zhì)控樣品冷凍后室溫融化，共3次后測量。制備后穩(wěn)定性操作是將處理好待分析的樣品放在HPLC的自動進(jìn)樣器中半天后測量。按上述色譜條件下進(jìn)行測定，分別進(jìn)樣，記錄色譜峰。

樣品在室溫下放置4 h期間沒有觀察到血漿和組織中分析物的濃度的顯著差異，濃度百分比為99.02%～101.33%，RSD為0.19%～7.91%。完成三個冷凍和解凍循環(huán)后，濃度百分比為98.05%～102.19%，RSD為0.19%～8.21%，加入血漿和組織的分析物的濃度不受冷凍和解凍試驗的顯著影響。分析物在血漿和組織中無明顯的降解，穩(wěn)定性良好。

2.8 含量測定 羥基喜樹堿脂質(zhì)體，以 2.5mg/kg 小鼠尾靜脈，注射藥物10 min后摘眼球取血，并立即處死取小鼠組織(心、肝、脾、肺、腎)，按照“2.1.2”項下方法處理，加入內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行測定。

計算給藥后小鼠肝臟、心臟、脾臟、肺臟及腎臟組織中羥基喜樹堿的含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果表

3 討論與小結(jié)

本實驗采用高效液相色譜法(HPLC)，利用其較好的選擇性、較高的靈敏性的特點，對藥物在生物樣品基質(zhì)中進(jìn)行檢測。建立了羥基喜樹堿在生物基質(zhì)中分析方法，高、中、低濃度的方法回收率均大于98%，平均提取回收率均大于70%，日內(nèi)、日間精密度均小于10% ，符合分析的要求，且方法專屬性較好。根據(jù)本課題前期工作研究[5]，得到羥基喜樹堿脂質(zhì)體制備方法。實驗中采用外標(biāo)法檢測時，回歸方程線性關(guān)系較差，且數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，改用以喜樹堿為內(nèi)標(biāo)的內(nèi)標(biāo)法后，線性關(guān)系明顯改善且數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，且與羥基喜樹堿得到較好的分離。故本實驗可運(yùn)用于動物體內(nèi)藥動學(xué)研究，同時也為羥基喜樹堿的體內(nèi)監(jiān)測提供一種有效的手段。

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