星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化肉桂油β-環(huán)糊精包合物制備工藝

★ 譚舒舒 皮達 陳歡 孫娟芳 胡源祥 楊武亮

(江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌 330004)

肉桂油為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl 的干燥枝、葉經(jīng)水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油[1]，其揮發(fā)油的主要成分為桂皮醛，相對含量在17.1%～73.9%，具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)靜、解熱鎮(zhèn)痛、抗焦慮、解表、發(fā)汗、抗腫瘤、降糖、神經(jīng)保護等多種藥理作用。對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管、腫瘤、糖尿病等疾病均有一定的防治作用[2-5]。但由于肉桂油對光與熱的不穩(wěn)定性，使其在應(yīng)用受到限制。目前，使用β-環(huán)糊精包合揮發(fā)油以提高其穩(wěn)定性的應(yīng)用較為普遍，β-環(huán)糊精包合物是包埋的水分子被相應(yīng)的客分子取代所形成的物質(zhì)，可增加藥物溶解度，掩蓋揮發(fā)油的異味，提高其生物利用度和患者順應(yīng)性[6]。對于肉桂油β-環(huán)糊精包合物的制備多采用正交設(shè)計或均勻設(shè)計進行研究，所得的包合物中桂皮醛的含量為2.99%～7.33%[7-9]。而星點設(shè)計-響應(yīng)面法(Central composite design-response surface methodology，CCD-RSM)是利用合理的實驗設(shè)計，在二水平析因設(shè)計的基礎(chǔ)上加上星點和中心點構(gòu)成的，可采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法，適用于多因素實驗設(shè)計，具有使用簡便、精度高、預(yù)測性好的優(yōu)點[10]。故本實驗采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化肉桂油β-環(huán)糊精包合物制備工藝，并進行預(yù)測分析，以高效液相色譜法(HPLC)和熱重差熱分析法(TG-DTA)對該包合物進行質(zhì)量評價，以期能夠最大程度的提高揮發(fā)油的利用率，為肉桂油的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 儀器 Agilent 1260(四元泵、VWD檢測器、自動進樣器)；日本精工熱重差熱綜合熱分析儀 EXSTAR6000 TG/DTA6300。

1.2 試藥 桂皮醛對照品(C11667480，含量測定用，德國 Dr.Ehrenstorfer)；β-CD (安徽山河藥用輔料股份有限公司)；肉桂油(自制，其中桂皮醛含量85.8%)；甲醇(HPLC級，西隴科學(xué)股份有限公司)；無水乙醇(西隴科學(xué)股份有限公司)；冰醋酸(國藥集團)；水為雙重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 肉桂油β-CD包合物的制備 取β-CD適量，精密稱定，加蒸餾水8倍水量，水浴加熱使其溶解，放冷至規(guī)定溫度，恒溫水浴研磨，量取揮發(fā)油適量，精密稱定，按 1∶1比例無水乙醇稀釋，將揮發(fā)油稀釋液緩慢注入β-CD溶液中(邊加邊研磨)，加入速度1mL/min，加完后繼續(xù)研磨，低溫冷藏24 h， 抽濾至干，適量無水乙醇洗滌3次，60 ℃真空干燥24 h，得白色粉末狀干燥包合物。

2.2 肉桂油β-CD包合物中桂皮醛的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 吸取桂皮醛對照品約10μL，精密稱定為0.01168g，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，從中精密吸取1mL，置另一個25mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得含46.72 μg/mL的桂皮醛對照品溶液。

2.2.2 肉桂油 β-CD包合物供試液溶液的制備 取肉桂油β-CD包合物約 0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶，精密加入甲醇50mL，稱定質(zhì)量，超聲處理 30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1mL，置25mL棕色瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18(250mm×4.6 mm,5μm)。流動相為甲醇：醋酸水(45∶55)；檢測波長為290 nm；流速為1.0 mL/mL；柱溫30℃；進樣量5μL。理論塔板數(shù)按桂皮醛峰計算，應(yīng)不得低于3000。色譜圖見圖1。

A.桂皮醛對照品；B.肉桂油包合物

2.2.4 線性范圍考察 精密吸取桂皮醛對照品溶液1，2，3，5，8，10，12μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以對照品的量(ng)為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=7.9114X+1.5039，R=0.9999。結(jié)果表明，桂皮醛進樣量在46.72～560.64ng范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液5 μL，在上述相同色譜條件下重復(fù)進樣6次，測定桂皮醛峰面積的RSD為0.97%。結(jié)果表明，6次測得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于2.0%，具有較好的精密度。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗 稱取最優(yōu)條件下制備的同一包合物樣品共6份，每份約0.5 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備供試液，測定桂皮醛的含量，計算桂皮醛含量的RSD為0.61 % 表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取最優(yōu)條件下制備的同一包合物樣品約0.5 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備供試液，分別在樣品制備后的0，2，4，8，10，12，24 h進樣，按照上述色譜條件測定桂皮醛峰面積，測得桂皮醛峰面積的RSD為0.38 %。結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗 稱取最優(yōu)條件下制備的同一包合物樣品(已知桂皮醛含量為 10.14 %)共6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別加入一定量的桂皮醛對照品(1.168mg/mL)溶液1 mL ，按供試品溶液的制備方法制備供試液測定，用下列公式計算加樣回收率。結(jié)果表明桂皮醛的平均回收率為100.32 %，RSD為1.84%，符合方法學(xué)要求，結(jié)果見表1。

表1 桂皮醛加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.2.9 肉桂油包合物的含量測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3 星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化肉桂油β-環(huán)糊精包合物制備工藝

2.3.1 包合物制備工藝最優(yōu)參數(shù)的確定 以肉桂油β-CD包合物中桂皮醛含量為評價指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定β-CD與肉桂油的包合比例(A)，包合溫度(B)及包合時間(C)作為響應(yīng)面實驗的自變量，根據(jù)星點設(shè)計的原理，每個因素設(shè)5個水平，用代碼值﹣α，-1，0，1，﹢α標(biāo)識，代碼值所代表的實際物理量如表2所示。

表2 實驗因素水平表

2.3.2 星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化包合工藝 采用Design-Expert 8.0.6軟件中的星點設(shè)計-響應(yīng)面法，以桂皮醛含量為評價指標(biāo)，根據(jù)實驗因素水平表，按2.1 肉桂油β-CD包合物的制備項下制備肉桂油β-CD包合物。試驗安排及結(jié)果見表3。

2.3.4 響應(yīng)面法分析方案與結(jié)果 應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對表3中實驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到擬合二次多項回歸模擬方程為：

Y=10.88-0.35A-0.59B-0.096C+0.77AB-0.82A2-0.58B2-0.53C2

表3 肉桂油β-CD包合工藝星點試驗分析

對上述擬合方程進行系數(shù)顯著性檢驗和方差分析，結(jié)果如表4所示。由表4可知方程的A、C2對實驗結(jié)果影響顯著，B、AB、A2、B2對實驗結(jié)果影響極顯著，但線性項和交互項影響不顯著，說明各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系?；貧w模型的Pr>F值為0.0007，差異高度顯著，失擬項Pr>F值為0.3763，大于0.05，影響不顯著，說明模型中無失擬因素存在，所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，說明回歸方程在整個回歸方程區(qū)域內(nèi)你和情況良好。方程決定系數(shù)R2為0.8347，說明響應(yīng)值的變化有83.47%來源于所選變量。模型中各自變量的三維響應(yīng)曲面見圖2，其響應(yīng)曲面圖直觀地反映了各因素交互作用對桂皮醛含量的影響，由圖可知肉桂油與β-CD的包合比例、包合溫度及包合時間對包合工藝的影響都比較顯著，兩兩因素間存在明顯交互作用。

利用該響應(yīng)面方程進行規(guī)劃，即優(yōu)化配置。選擇求桂皮醛最大值點并運算，得研磨法制備肉桂油β-CD包合物的最佳工藝為：β-CD與肉桂油的比例為9.9976∶1、包合溫度為49.7 ℃、包合時間為58.3935 min。將各因素進行微調(diào)以適應(yīng)實際生產(chǎn)，最終確定包合物制備的最佳包合工藝為β-CD與肉桂油的比例為10∶1、包合溫度為50 ℃、包合時間為58 min。

2.3.5 最佳包合工藝驗證 按星點設(shè)計-響應(yīng)面法所確定的最佳包合工藝參數(shù)，制備肉桂油β-CD包合物樣品3份，測定包合物中桂皮醛含量。結(jié)果分別測得桂皮醛含量為：10.14%，10.05%，10.15%。平均含量為10.11%。預(yù)測值為10.21%，偏差率分別為0.68%，1.56%和0.98%。該擬合模型較好地反映工藝中各因素與評價指標(biāo)之間的關(guān)系，且穩(wěn)定可靠。

表4 回歸模型方差分析表

圖2 包合比例、包合溫度和包合時間對肉桂油

2.4 包合物的熱重-差熱分析鑒別 取適量的空白β-CD粉末(A)，適量的β-CD粉末與肉桂油的物理混合物(B)和肉桂油β-CD包合物(C)為樣品，置于瓷坩堝中，三者樣品稱樣量分別為2.657，3.064，3.306 mg。掃描條件為：以空坩堝為參比；氮氣；升溫速率：10.00 ℃/min；升溫范圍：0 ～ 500 ℃。掃描可得三者的TG-DTA曲線，結(jié)果見圖3。

從樣品β-CD(A)的TG-DTA圖譜可以看出，β-CD失重分為兩個階段：第一階段溫度范圍是70℃～100 ℃(TG曲線)，對應(yīng)的吸熱峰為90 ℃(DTA曲線)，該峰是β-CD的失水峰；第二階段溫度范圍是290℃～350 ℃，對應(yīng)的吸熱峰為320 ℃，為β-CD自身氧化分解峰。

從樣品β-CD與肉桂油的物理混合物(B)的TG-DTA圖譜可以看出，樣品A，B的TG-DTA圖譜十分相似 ，而且吸熱峰的位置和峰形大小也十分接近。但其失重分為三個階段：第一階段與第三階段失重的溫度范圍和對應(yīng)的吸熱峰基本一致，但第二階段溫度范圍是100℃～150℃，對應(yīng)的吸熱峰為130℃，為桂皮醛的氣化峰。

A：β-CD；B：肉桂油與β-CD物理混合物；C：肉桂油β-CD包合物

而樣品肉桂油β-CD包合物(C)的TG-DTA圖譜可以看出，與A，B相比，β-CD的失水峰已經(jīng)消失，是由于在包合過程中β-CD已經(jīng)失去了內(nèi)腔的結(jié)晶水，進而被桂皮醛占據(jù)了。其失重的溫度范圍是290～350 ℃，對應(yīng)的吸熱峰為320 ℃，為β-CD自身氧化分解峰。此外，由于β-CD與桂皮醛的相互作用力，使得體系熱穩(wěn)定性增加使得吸熱峰與A，B相比都要滯后一些。表明肉桂油β-CD包合物已經(jīng)形成。

3 討論

本實驗得到肉桂油β-環(huán)糊精包合物最佳制備工藝條件為：β-CD與肉桂油的包合比例(g/g)10∶1，包合溫度50 ℃，包合時間58 min，在此條件下所得包合物中桂皮醛平均含量為10.10%，且經(jīng)熱重-差熱分析鑒別表明該包合物已經(jīng)形成。故采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化肉桂油β-環(huán)糊精包合物的最佳制備工藝穩(wěn)定、可靠，且肉桂油被 β-CD 包合后，對光和熱的穩(wěn)定性顯著提高，為其廣泛臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

桂皮醛為肉桂油的主要成分，具有抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、神經(jīng)保護等藥理作用，故本實驗以包合物中桂皮醛含量為評價指標(biāo)。本實驗曾比較過研磨法、飽和水溶液法、超聲法及膠體磨法對肉桂油β-環(huán)糊精包合物影響，發(fā)現(xiàn)研磨法所得的包合物中桂皮醛的含量較高，故采用研磨法制備該包合物。本實驗包合物制備過程中，在研磨靜置之后采用適量雙蒸水及無水乙醇洗滌，將未進行包合的β-CD和肉桂油沖洗掉，發(fā)現(xiàn)實際所得包合物為投料量的80%～90%，且當(dāng)β-CD與肉桂油的包合比例為10∶1時，所得包合物中桂皮醛平均含量為10.10%，故可能實際研磨過程中β-CD與肉桂油的包合比例小于投入量的比例，實際包合比例可能為8.5∶1，導(dǎo)致桂皮醛平均含量大于10%。目前肉桂油包合物的制備多以揮發(fā)油的包合率為評價指標(biāo)進行正交試驗、均勻設(shè)計或單因素篩選包合工藝[7-9]，本實驗采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法并結(jié)合 Design-Expert 8.0.6軟件擬合數(shù)學(xué)模型，具有良好的預(yù)測性，從多個角度考察、評價，從而得到一個理論的最佳條件，再從實際的實驗操作出發(fā)，驗證出理論最優(yōu)條件的可行性。

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