快速溶劑萃取-凝膠凈化-高效液相色譜法測定土壤中6種鄰苯二甲酸酯

郭文建，張 慧，朱 晨，李紅莉，岳太星，李洪霞，郭文波

1.山東省環(huán)境監(jiān)測中心站，山東 濟南 250101 2.山東大學環(huán)境科學與工程學院，山東 濟南 250013 3.青島國家海洋科學研究中心，山東 青島 266071

鄰苯二甲酸酯(PAEs)，又稱酞酸酯，是一類人工合成可起軟化作用的化合物，因其可顯著提高塑料的可塑性和強度，被廣泛用作增塑劑[1]。此外，它也可作為農(nóng)藥載體、驅(qū)蟲劑、化妝品、潤滑劑、去污劑的生產(chǎn)原料[2]。近年來，隨著PAEs的大量生產(chǎn)和廣泛使用，此類化合物在各種環(huán)境介質(zhì)(如，空氣、土壤、水體)中均被檢測到[3]。已有研究表明，該類化合物具有內(nèi)分泌干擾效應[4]，可通過呼吸、飲食、皮膚接觸等進入人和動物體內(nèi)，危害人類健康及生態(tài)環(huán)境[5]。目前，由PAEs引起的環(huán)境污染已經(jīng)引起了廣泛關注。美國環(huán)保署(US EPA)已將鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、二乙酯(DEP)、正二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、二辛酯(DNOP)、丁基芐基酯(BBP)6種PAEs列入了“優(yōu)先監(jiān)測污染物名單”，并制定了相應的土壤環(huán)境控制標準及土壤污染治理標準。中國也將DMP、DBP、DOP列入優(yōu)先控制污染物黑名單[6]。此外，在2005年開始實施的全國土壤污染現(xiàn)狀調(diào)查專項中，將PAEs列為土壤必測項目之一[7]。

氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8-10]及液相色譜法(HPLC)[11-12]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[13-14]是常用的PAEs分析檢測手段。由于PAEs的高沸點特性使得應用GC或GC-MS時的難度增加，相比較而言，HPLC適用范圍更為廣泛，可用于大多數(shù)有機化合物的檢測分析[15]。此外，要想準確測定環(huán)境介質(zhì)中的PAEs，樣品的前處理是必不可少的。索氏提取、微波萃取、超聲萃取、快速溶劑萃取(ASE)等是常用的土壤樣品前處理方法[16-17]。較其他方法而言，快速溶劑萃取法具有有機溶劑用量少，萃取速率快，回收率高等特點，在固體樣品前處理方面表現(xiàn)出很好的應用前景。閆蕊[16]等對比了快速溶劑萃取法、索氏萃取法、超聲萃取法下土壤樣品中11種PAEs的回收率，以及萃取溶劑使用量、萃取時間等；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，快速溶劑萃取法的回收率最佳、溶劑使用量最少、萃取速率最快，且萃取液的色譜峰干擾少，后2種方法僅對部分PAEs有萃取作用。

當前，文獻中報道的PAEs檢測方法多為單一PAEs的檢測，并未考慮共存污染物的干擾。然而，實際的土壤基質(zhì)中往往是多種有機污染物共存，在對樣品萃取液采用液相色譜法檢測時，其他共溶出的有機物往往會干擾PAEs的測定，從而使準確測定PAEs濃度的難度增加。因此，開發(fā)可準確測定含共存污染物土壤中PAEs濃度的方法很有必要。多環(huán)芳烴(PAHs)是可持續(xù)污染物(POPs)的一種，廣泛存在于土壤中，且大多數(shù)的PAHs 在225 nm波長下均有吸收。因此，共存的PAHs可影響PAEs在其特征吸收波長(200、225、275 nm)下的響應，從而干擾PAEs的準確測定。本文重點是排除共存的PAHs對PAEs測定的干擾，為后續(xù)準確測定實際土壤樣品中的PAEs提供思路。凝膠凈化(GPC)是常用的土壤凈化手段，各組分流經(jīng)凝膠層析凈化柱后，可按分子的大小依次被洗脫出來，采集相應時間段的洗脫液，進行后續(xù)檢測。研究表明，經(jīng)凝膠滲透色譜凈化后，可有效去除土壤中共存污染物對16種PAHs的干擾，且具有好的回收率[18]。此外，在土壤中有機氯農(nóng)藥的測定方面，也得到了應用[19]。目前，還未有關于PAHs共存的情況下高效液相色譜(HPLC)法準確測定PAEs方法的報道。

研究首先通過ASE快速萃取出土壤中共存的16種PAHs與6種PAEs，而后進行凝膠凈化，通過對洗脫液的分段收集，去除共存的PAHs對PAEs測定的干擾，從而達到準確測定土壤樣品中6種PAEs的目的。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(日本)，配二極管陣列(DAD)和熒光(FLD)檢測器；ZORBAX Eclipse Plus C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；ASE-350型快速溶劑提取儀(美國)，配34 mL萃取池；LC-Tech凝膠滲透色譜儀；Bio-Beads SX-3凝膠層析柱(500 mm×25 mm，粒徑37～74 μm)；有機樣品濃縮儀(瑞典)；分析天平(瑞士)；硅藻土(美國)；石英砂(美國)；6種鄰苯二甲酸酯，16種PAHs，購自美國AccuStandard公司；二氯甲烷、丙酮、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、乙腈均為色譜純(美國)；實驗用水為超純水(美國)。

1.2 標準溶液

6種PAEs及16種PAHs的儲備液濃度均為100 mg/L，準確稱取一定量的標準物質(zhì)，以乙腈為溶劑，配成儲備液，于 4 ℃下保存。使用時，用乙腈逐級稀釋儲備液，得到不同濃度的標準混合溶液。

1.3 樣品制備

空白加標，準確稱取5.00 g石英砂，作為空白土壤樣品，加入5 g硅藻土，混合均勻后置于34 mL ASE萃取池中，微量注射器加入一定量的標準混合溶液。

基體(樣品)加標，準確稱取去除雜質(zhì)的新鮮土樣5.00 g，加入5 g硅藻土，充分混勻、脫水，研磨至散粒狀，作為實際土壤樣品，置于34 mL ASE萃取池中，微量注射器加入一定量的標準混合溶液。土壤樣品干物質(zhì)測定按照《土壤 干物質(zhì)和水分的測定 重量法》(HJ 613—2011)執(zhí)行，樣品定量分析時全部以干物質(zhì)計算。

1.4 樣品前處理

將制備好的土壤樣品裝入34 mL萃取池中，以二氯甲烷-丙酮(體積比為1∶1)為萃取溶劑進行萃取。萃取溫度100 ℃，萃取體積為60%，萃取壓力為1 500 psi，預熱平衡5 min，靜態(tài)萃取10 min，循環(huán)2次，氮氣吹掃60 s，收集全部提取液，進入GPC三聯(lián)機模式(預濃縮-凈化-濃縮)。預濃縮參數(shù)：濃縮腔溫度40 ℃，高真空度0.03 MPa，低真空度0.032 MPa。濃縮參數(shù)：濃縮腔溫度40 ℃，真空度在0.018 MPa,低真空度0.2 MPa。洗脫溶劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(體積比為1∶1)，流速5 mL/min，進樣量5 mL，收集12～28 min流出液，并濃縮至1 mL(溶劑置換為乙腈)，待分析。

1.5 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(150×4.6 mm，5 μm)色譜柱，柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL。流動相：水(A)-乙腈(B)。梯度洗脫程序：0～2 min，流動相B保持為55%；2～6 min，B相由55%線性升至100%，保持9 min；15～16 min，B流動相降為55%，維持2 min。定量波長為225 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 ASE萃取溶劑的選擇

二氯甲烷、正己烷、丙酮等是常用的PAEs的萃取溶劑。在US EPA 3500方法中采用正己烷-丙酮混合溶劑、二氯甲烷-丙酮混合溶劑提取固體樣品中的PAEs，效果較好。實驗對比研究了二氯甲烷-丙酮(體積比為1∶1)、二氯甲烷-正己烷(體積比為1∶1)、丙酮-正己烷(體積比為1∶1)3種萃取溶劑下PAEs的萃取效率，并篩選出最佳的PAEs萃取溶劑?；厥章蕯?shù)據(jù)表明，經(jīng)二氯甲烷-丙酮(體積比為1∶1)提取后，6種PAEs的回收率為90%～121.7%，優(yōu)于其他2種溶劑的萃取效率(圖1)。此外，經(jīng)這3種混合溶劑快速萃取后，PAHs也被萃取出來，且3種混合溶劑作用下16種PAHs的萃取回收率幾乎相同，依次為68.7%～122.1%、73.2%～119.0%、61.0%～109.0%。因此，實驗選取二氯甲烷-丙酮(體積比為1∶1)作為土壤中PAEs的萃取溶劑。

注：3種混合萃取溶劑的體積比均為1∶1。圖1 不同萃取溶劑對PAEs回收率的影響Fig.1 Effects of extraction solvent on the recovery of PAEs

2.2 GPC收集時間的確定

一般來說，實際的土壤樣品中會含有多種有機污染物，在進行一般的提取處理時，共存污染物往往會同目標物一同萃取到溶劑相中，這可能會對后續(xù)目標物的準確定量增加難度。PAHs是可持續(xù)污染物的一種，廣泛存在于土壤中。研究選定的色譜條件下對16種PAHs進行了液相-紫外檢測分析，發(fā)現(xiàn)16種PAHs出峰時間在7.5～12.5 min時，會干擾DBP(9.4 min)和BBP(9.7 min)的測定。對比6種PAEs和16種PAHs的流出曲線發(fā)現(xiàn)，6種PAEs在28 min已經(jīng)完全洗脫，而PAHs在26 min后，才開始有萘的洗脫(圖2)。因此，準確測定這6種PAEs只需收集12～28 min的流出液，而此時間段的流出液即能夠保證土壤中PAHs的有效去除，同時又能夠保證被測組分的全部接收。

為驗證經(jīng)GPC凈化后，16種PAHs對目標污染物測定的干擾得到了去除，分別對凈化前的ASE萃取液和凈化后的流出液(12～28 min)進行HPLC檢測分析。取2份等量的空白土壤(石英砂)，分別與5 g硅藻土混勻，然后加入相同量的PAEs和16種PAHs標準混合溶液，經(jīng)ASE萃取后，一份樣品萃取液經(jīng)直接濃縮、定容后進行HPLC檢測分析(圖3)。另一份樣品萃取液進行GPC凈化處理，收集12～28 min的流出液，此時間段流出液經(jīng)濃縮、定容后進行檢測分析(圖4)。對比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GPC凈化處理后，16種PAHs的干擾得到了有效去除。這也說明，采用GPC通過收集不同時間段的流出液來去除PAHs對PAEs測定的干擾的思路是可行的。

圖2 PAEs、PAHs的GPC流出曲線Fig.2 Outflow curves of PAEs and PAHs

圖3 樣品凈化前色譜圖Fig.3 The chromatogram before purification

圖4 樣品凈化后色譜圖Fig.4 The chromatogram after purification

2.3 方法的驗證

2.3.1 校正曲線與檢出限

取不同濃度的6種PAEs混合標準溶液(0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL)分別進樣，以峰面積對濃度做線性回歸分析。在選定色譜條件下，6種PAEs的線性關系良好，相關系數(shù)大于0.999 9。分析7個空白加標樣品，計算標準偏差(S)。方法檢出限計算公式如下：

MDL=t(n-1,0.99)S

(1)

式中：MDL為方法檢出限，t(n-1,0.99)為置信度99%、自由度(n-1)時的t值。求得PAEs的方法檢出限，4倍的檢出限為其測定下限。如表1所示，6種PAEs的檢出限為2.7～11.5 μg/kg,完全滿足實際樣品的定量分析要求。

表1 6種PAEs的線性方程與檢出限Table 1 Linear equation and detection limits for the determination of six PAEs

2.3.2 方法精密度與準確度

對實驗室空白加標樣品進行方法精密度與準確度實驗，其中，PAEs加標濃度為133 μg/kg；PAHs為66.7 μg/kg，經(jīng)ASE和GPC后，在最佳色譜條件下，進行6次連續(xù)測定。由表2可見，6種PAEs濃度的相對標準偏差為4.23%～10.1%，回收率為76.2%～91.4%，滿足檢測需求。

表2 空白加標樣品的回收率、精密度Table 2 RSD and recovery rate of blank spiked soil sample

2.4 實際樣品分析

對底泥及表層土壤樣品進行分析，2種土壤樣品均有PAEs檢出(表3)。對2種土壤樣品進行了加標回收實驗，其中，6種PAEs的加標濃度分別為66.7、133、267 μg/kg，16種PAHs的加標濃度為66.7 μg/kg。由表3可見，在底泥和表層土壤2種樣品不同加標濃度下，樣品的平均加標回收率為66.5%～102%，相對標準偏差為1.5%～9.5%。說明該方法穩(wěn)定，回收率較高，具有實際應用價值。

表3 2種土壤樣品中6種PAEs的測定值、加標回收率、相對標準偏差(n=6)Table 3 Determination, recovery rate and RSD of two soil samples (n=6)

3 結(jié)語

研究采用ASE對土壤中的PAEs進行提取，并過Bio-Beads SX-3凝膠層析柱凈化，通過分段收集，消除了土壤中共存的16種PAHs在225 nm紫外波長下對6種PAEs測定的干擾。此方法的回收率為66.5%～102%，檢出限為2.7～11.5 μg/kg，相對標準偏差為1.5%～9.5%。方法萃取效率高，精密度及檢出限較好，可適用于含PAHs的土壤中PAEs的準確測定，具有較好的實際應用價值。

參考文獻(References)：

[1] 劉慶,楊紅軍,史衍璽,等.環(huán)境中鄰苯二甲酸酯類(PAEs)污染物研究進展[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報, 2012, 20(8)：968-975.

LIU Qing, YANG Hongjun, SHI Yanxi, et al. Research Progress on Phthalate Esters (PAEs) Organic Pollutants in the Environment [J].Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2012, 20(8)：968-975.

[2] 王超英,李碧芳,李攻科. 固相微萃取/高效液相色譜聯(lián)用分析水樣中鄰苯二甲酸酯[J]. 分析測試學報, 2005, 24(5)：35-38.

WANG Chaoying, LI Bifang, LI Gongke. Determination of Phthalate Esters in Water Samples by Solid-Phase Microextraction and High Performance Liquid Chromatography [J]. Journal of Instrumental Analysis, 2005, 24(5):35-38.

[3] 張海光, 孫國帥, 孫磊, 等. 典型覆膜作物土壤中鄰苯二甲酸酯污染的初步研究[J]. 中國環(huán)境監(jiān)測, 2013, 29(4)：124-124.

ZHANG Haiguang, SUN Guoshuai, SUN Lei,et al. Preliminary Study on Phthalic Acid Esters Pollution of Typical Plastic Mulched Crops Soils[J]. Environmental Monitoring in China, 2013, 29(4)：60-63.

[4] STAPLES C A, PETERSON D R, PARKERTON T F, et al. The Environmental Fate of Phthalate Esters：a Literature Review [J]. Chemosphere, 1997, 35(4)：667-749.

[5] 劉慧杰, 舒為群. 鄰苯二甲酸酯類化合物的毒理學效應及對人群健康的危害[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2004, 26(19)：1 778-1 781.

LIU Huijie, SHU Weiqun. Toxicolgical Effect and Risk of Phthalate Acid Esters on the Health of Population[J]. Acta Academiae Medicinae Miltaris Tertiae, 2004, 26(19)：1 778-1 781.

[6] 蔣麗佳,許秋瑾,梁存珍,等. 江蘇某縣地下水鄰苯二甲酸酯類的檢測與風險評價[J]. 中國環(huán)境監(jiān)測, 2013, 29(4)：5-10.

JIANG Lijia, XU Qiujin, LIANG Cunzhen, et al．Detection and Risk Assessment of Phthalates in Groundwater in a Country of Jiangsu Province[J]. Environmental Monitoring in China, 2013, 29(4)：5-10.

[7] 陳永山,駱永明,章海波,等. 設施菜地土壤酞酸酯污染的初步研究[J]. 土壤學報, 2011, 48(3)：516-523.

CHEN Yongshan, LUO Yongming, ZHANG Haibo, et al．Preliminary Study on PAEs Pollution of Greenhouse Soils[J]． Acta Pedologica Sinica, 2011, 48(3)：516-523.

[8] PENALVER A, POCURULL E, BORRULL F, et al. Determination of Phthalate Esters in Water Samples by Solid-Phase Microextraction and Gas Chromatography with Mass Spectrometric Detection [J]. Journal of Chromatography A, 2000, 872(1)：191-201.

[9] 王玲玲,王瀟磊,劉丹,等. 土壤介質(zhì)中酞酸酯類污染物分析方法研究[J]. 中國環(huán)境監(jiān)測, 2009, 25(4)：4-7.

WANG Lingling, WANG Xiaolei, LIU Dan, et al. Study on the Accuracy & Precision of the Method of Anlysis Phthalate Esters in Soil[J]. Environmental Monitoring in China，2009，25(4)：4-7.

[10] 朱媛媛,田靖,王偉,等.土壤中15種酞酸酯類化合物測定[J].中國環(huán)境監(jiān)測,2009, 25(2)：79-83.

ZHU Yuanyuan, TIAN Jing, WANG Wei, et al. Determination of 15 Kinds of Phthalate in Soil [J]. Environmental Monitoring in China, 2009, 25(2)：79-83.

[11] 曹攽,馬軍,劉清輝.索氏提取-液相色譜法測定土壤中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)[J]. 地質(zhì)學刊, 2011, 35(1)：73-77.

CAO Ban, MA Jun, LIU Qinghui. Determination of Phthalic Acid Esters in Soils by Soxhlet Technology-High Precision Liquid Chromatography [J]. Journal of Geology, 2011, 35(1)：73-77.

[12] 徐磊,夏寧.在線固相萃取/高效液相色譜法測定環(huán)境水樣中的4種痕量鄰苯二甲酸酯[J].分析測試學報, 2011, 30(5)：558-561.

XU Lei, XIA Ning. Determination of Four Trace Phthalates in Water by Online SPE Coupled with High Performance Liquid Chromatography[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2011, 30(5)：558-561.

[13] 劉超,李來生,王上文,等. 液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用法測定飲料中的鄰苯二甲酸酯[J].色譜, 2007, 25(5)：766-767.

LIU Chao, LI Laisheng, WANG Shangwen, et al. Determination of Phthalates in Drink by HPLC-ESI-MS. Chinese Journal of Chromatography, 2007, 25(5):766-767.

[15] 沈小明,時磊,呂愛娟,等. 高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定鄰苯二甲酸酯色譜條件優(yōu)化[J]. 中國環(huán)境監(jiān)測,2015,31(6):97-102.

SHEN Xiaoming, SHI Lei, LYU Aijuan, et al. Optimization of Chromatographic Conditions for Determination of Phthalic Acid Esters by High Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detector[J]. Environmental Monitoring in China, 2015, 31(6)：97-102.

[16] 閆蕊,邵明媛,孫長華,等. 加速溶劑萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定土壤中鄰苯二甲酸酯[J].分析化學,2014,42(6)：897-903.

YAN Rui, SHAO Mingyuan, SUN Changhua, et al. Determination of 11 Phthalic Acid Esters in Soil by Accelerated Solvent Extraction-Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2014, 42(6)：897-903.

[17] 邵海洋,徐剛,吳明紅,等.加速溶劑萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測沉積物中痕量增塑劑[J].分析化學, 2013, 41(9)：1 315-1 321.

SHAO Haiyang, XU Gang, WU Minghong, et al. Determination of Phthalate Esters in Sediment Using Accelerated Solvent Extraction and Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013, 41(9)：1 315-1 321.

[18] 張茜,劉瀟威,羅銘,等.快速溶劑(ASE)提取,凝膠滲透色譜(GPC)聯(lián)合固相萃取(SPE) 凈化,高效液相色譜法測定土壤中的多環(huán)芳烴[J].環(huán)境化學, 2011, 30(4)：771-777.

ZHANG Qian, LIU Xiaowei, LUO Ming, et al. Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Soil by ASE-GPC-SPE Purification and HPLC Detection[J]. Envrionmental Chemistry, 2011, 30(4)：771-777.

[19] 陳啟榮, 郎爽, 魏巖, 等. 加速溶劑萃取-凝膠色譜凈化-氣質(zhì)聯(lián)用測定土壤中15種有機氯農(nóng)藥殘留的方法研究[J]. 分析測試學報, 2010, 29(5)：473-477.

CHEN Qirong, LANG Shuang, WEI Yan, et al. Determination of 15 Organochlorine Pesticides in Soil by Gas Chromatography-Mass Spectrometry with Accelerated Solvent Extraction and Gel Permeation Chromatograph[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2010, 29(5)：473-477.