姜黃素抑制CD44+結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的體外實(shí)驗研究①

郗雪艷 付 飛 樊 旭 杜伯雨

(湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，十堰 442000)

①本文為國家自然科學(xué)基金應(yīng)急管理項目(81650019)和湖北省科技廳面上項目(2017CFB551，2017CFB462)。

②通訊作者，E-mail:du.boyu@hotmail.com。

作者簡介：郗雪艷，女，博士，副研究員，主要從事腫瘤免疫方面研究，E-mail:xixueyan2001@126.com。

據(jù)我國2011年流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，結(jié)腸癌在惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率中均排第五位，分別為23.03/10 萬和11.11/10萬[1]。由于傳統(tǒng)術(shù)后化療藥物毒副作用大、靶性不強(qiáng)、療效差且易產(chǎn)生耐藥性，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌治療失敗的主要原因。因此尋找特異性靶點(diǎn)并克服結(jié)腸癌的耐藥性是結(jié)腸癌治療中亟待解決的問題之一，對降低結(jié)腸癌的發(fā)病率并提升病人的生存質(zhì)量至關(guān)重要。越來越多的證據(jù)表明，結(jié)腸癌組織中可能存在數(shù)量稀少的結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells,CSC)[2-4]，其具有自我更新、增殖和分化的潛能，在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起重要作用。結(jié)腸癌組織中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和CD44均高表達(dá)，O′Brien等[5]最早在2007年發(fā)現(xiàn)人結(jié)腸癌手術(shù)切除標(biāo)本中，分離得到的細(xì)胞有20%左右是CD133+細(xì)胞，并且這種細(xì)胞具有干細(xì)胞特征，能夠在小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生新的腫瘤細(xì)胞。由結(jié)腸癌組織分離得到的單一CD44+腫瘤細(xì)胞在體外即可形成腫瘤球，并且在裸鼠體內(nèi)接種100個CD44+細(xì)胞即可成瘤[6]，說明CD44+結(jié)腸癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的腫瘤干細(xì)胞特征。

姜黃素(Curcumin)是一種從姜黃根莖中提取的生物活性物質(zhì)，屬酸性多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌等藥理作用[7]。近年來，由于其抗腫瘤活性強(qiáng)，抗腫瘤譜廣、毒副作用小等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用到多種腫瘤治療的研究中，其在結(jié)腸癌治療中的作用尤為引人關(guān)注。研究表明，姜黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用[8,9]，可導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD44和CD166表達(dá)下調(diào)，干細(xì)胞成球數(shù)量明顯減少[10]，并且姜黃素衍生物GO-Y030可抑制結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的活性和增殖效應(yīng)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞移植瘤生長[11]，提示姜黃素對結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞具有抑制作用。

本研究中，我們著重探討姜黃素對CD44+結(jié)腸癌細(xì)胞的影響。我們首先證明姜黃素可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和HT-29細(xì)胞的增殖，然后通過Real-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗證明姜黃素處理的結(jié)腸癌細(xì)胞CD44表達(dá)下調(diào)，最后磁珠分選出CD44+的結(jié)腸癌細(xì)胞，證明姜黃素可抑制CD44+細(xì)胞的增殖。本文結(jié)果為探討姜黃素作為結(jié)腸癌治療輔助性藥物的可能行提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 姜黃素，McCoy′s 5A 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和MTT購自Sigma-Aldrich公司；胎牛血清購自Gibco公司；FITC標(biāo)記的CD44抗體購自Ebioscience公司；CD44分選磁珠及磁珠分選專用緩沖液購自Miltenyi公司；Triozol購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；SYBR Green購自ToBoYo公司；PCR引物由生工公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和HT-29購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。細(xì)胞生長在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的McCoy′s 5A完全培養(yǎng)基中，含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗 0.25%胰酶+0.02% EDTA消化HCT116和HT-29細(xì)胞后，用完全培養(yǎng)基制備成單個細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/ml。向96孔板中每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，37℃過夜培養(yǎng)。然后加入不同劑量的姜黃素處理24 h，每孔加入10 μl MTT作用4 h，最后加入150 μl二甲基亞砜溶解甲臢顆粒，490 nm處讀取吸光度值。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗組平均OD值-空白對照組平均OD值)/(對照組平均OD值-空白對照組平均OD值)×100%。

1.2.3Real-time PCR 通過 Real-time PCR檢測對照組和實(shí)驗組細(xì)胞中CD44 mRNA 的表達(dá)水平。不同濃度姜黃素處理細(xì)胞 24 h后，提取各組細(xì)胞總 RNA，MMLV反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以 cDNA 為模板，通過 PCR 擴(kuò)增CD44，內(nèi)參為GAPDH。CD44正向引物為：5′-GGCACCCGCTATGTCCAGAA-3′；CD44反向引物為5′-CCTCCTGAAGTGCTGCTCCT-3′；GAPDH正向引物為：5′-AGCTCACTGGCATGGC-CTTC-3′；GAPDH反向引物為5′-CGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′。之后對溶解曲線進(jìn)行分析，確保只有單一產(chǎn)物被擴(kuò)增，然后使用Bio-rad CFX mana-ger3.1軟件進(jìn)行基因表達(dá)分析。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù) 離心收集不同劑量姜黃素和5-氟脲嘧啶(5-FU)處理24 h后的HCT116和HT-29細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞2次后，以100 μl PBS重懸細(xì)胞，加入1 μl FITC標(biāo)記的 CD44抗體，4℃避光作用30 min 后，應(yīng)用Beckman公司CytExpert流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD44表達(dá)情況。

1.2.5磁珠分選 CD44+結(jié)腸癌細(xì)胞分選采用Miltenyi公司的陽性分選磁珠，所有分選過程采用Miltenyi公司專用的緩沖液(130-091-221)。收集細(xì)胞懸液后，加入緩沖液1 ml，300 g離心5 min，棄上清，將細(xì)胞沉淀重懸于80 μl緩沖液中，加入CD44+分選磁珠20 μl，4℃孵育30 min，期間反復(fù)混勻數(shù)次，然后加入緩沖液1 ml重懸細(xì)胞，300 g離心5 min，棄上清，同樣操作重復(fù)洗細(xì)胞2次，沉淀重懸于500 μl緩沖液中，將上述細(xì)胞懸液加入分選柱中，收集滴落的細(xì)胞液，此為陰性分選的細(xì)胞，待細(xì)胞懸液滴入完畢后，將分選柱從磁力架上移下，向分選柱中加入500 μl洗液，以活塞推動細(xì)胞，收集細(xì)胞，此為陽性分選的細(xì)胞。分選完畢的細(xì)胞以流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1姜黃素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖 不同劑量姜黃素作用于結(jié)腸癌HCT116和HT-29細(xì)胞24 h后，應(yīng)用MTT方法檢測姜黃素對兩種結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖1所示，姜黃素可抑制HCT116和HT-29細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。

2.2姜黃素可致結(jié)腸癌細(xì)胞CD44 mRNA表達(dá)下調(diào) 不同劑量的姜黃素處理結(jié)腸癌細(xì)胞24 h后，應(yīng)用Real-time PCR檢測結(jié)腸癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物CD44的表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果如圖2所示，不同劑量的姜黃素處理結(jié)腸癌細(xì)胞后，干細(xì)胞標(biāo)記物CD44的表達(dá)水平在HCT116和HT-29兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系中均呈現(xiàn)劑量依賴性下降。

2.3姜黃素可致結(jié)腸癌細(xì)胞表面CD44表達(dá)下降 分別應(yīng)用姜黃素和5-FU處理結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和HT-29，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)腸癌細(xì)胞表面CD44表達(dá)的水平，結(jié)果如圖3所示，隨著姜黃素劑量增加，結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和HT-29表面CD44表達(dá)水平逐漸下降；而不同濃度的結(jié)腸癌廣譜化療藥物5-FU雖然可以有效的殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞，但并不能引起CD44表達(dá)下調(diào)。

圖1 姜黃素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和HT-29增殖Fig.1 Proliferation inhibition effect of curcumin against colon cancer cells,HCT116 and HT-29

圖2 姜黃素處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞系CD44的表達(dá)下調(diào)Fig.2 Downregulation of CD44 expression in colon cancer cells treated with curcuminNote: *.P<0.05.

2.4姜黃素抑制CD44+的結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖 應(yīng)用磁珠分選法分離結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和HT-29中CD44+和CD44-細(xì)胞，加入不同劑量姜黃素和5-FU處理24 h后，檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果如圖4所示，不同劑量的姜黃素對CD44+細(xì)胞的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于其對CD44-細(xì)胞的作用，而不同劑量的5-FU對CD44+和CD44-結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用在兩種細(xì)胞之間并未有明顯差別，提示姜黃素可特異性抑制CD44+結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

圖3 姜黃素處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞CD44表達(dá)下降Fig.3 Downregulation of CD44 in colon cancer cell after treated by curcumin

圖4 姜黃素可以抑制CD44+結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖Fig.4 Proliferation inhibition effects of curcumin against CD44+ colon cancer cellsNote: *.P<0.05.

3 討論

作為我國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤，結(jié)腸癌當(dāng)前仍以手術(shù)治療為主，輔以放療和化療。但隨化療時間的延長，結(jié)腸癌細(xì)胞會逐漸產(chǎn)生多藥耐藥性，導(dǎo)致化療失敗。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，耐藥性的產(chǎn)生與腫瘤組織中存有少量的腫瘤干細(xì)胞有關(guān)[12-14]。因此特異性地消滅腫瘤干細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞失去分化潛能似乎成為腫瘤治療的又一個希望[15]。

近年來，姜黃素對腫瘤干細(xì)胞的作用引人關(guān)注，姜黃素可導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD44和CD166表達(dá)下調(diào)，干細(xì)胞成球數(shù)量明顯減少[8]。本研究中，我們著重探討姜黃素對CD44+細(xì)胞的影響。本研究結(jié)果首先提示姜黃素可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和HT-29細(xì)胞增殖，應(yīng)用姜黃素處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞，其結(jié)腸癌特異性干細(xì)胞表面標(biāo)記物 CD44在兩株結(jié)腸癌細(xì)胞中均有不同程度下調(diào)。同時流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果提示姜黃素處理的結(jié)腸癌細(xì)胞表面CD44表達(dá)水平隨姜黃素劑量增加而下調(diào)，而添加5-FU的結(jié)腸癌細(xì)胞表面并未有明顯的CD44表達(dá)下調(diào)。此外，應(yīng)用磁珠分選獲得CD44+和CD44-的結(jié)腸癌細(xì)胞后，加入不同劑量的姜黃素處理細(xì)胞，結(jié)果證明姜黃素可特異性抑制CD44+結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。由于CD44+結(jié)腸癌細(xì)胞已被認(rèn)為具有很強(qiáng)的腫瘤干細(xì)胞特征[6,16,17]，綜合以上結(jié)果，提示姜黃素可通過抑制結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞增殖達(dá)到治療結(jié)腸癌的目的。

大量研究表明，姜黃素可以通過直接或間接影響腫瘤干細(xì)胞自我更新通路干預(yù)腫瘤干細(xì)胞生長，例如 Wnt/β-catenin，Hedgehog 和Notch通路[18-20]，但其如何調(diào)控結(jié)腸癌干細(xì)胞CD44的表達(dá)尚不明確，有待進(jìn)一步研究。而姜黃素作為一種植物來源的藥物，又表現(xiàn)出對結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的抑制效果，未來或可成為治療結(jié)腸癌、抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞生長、防止結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的一個重要靶向藥物。

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