MEOX2基因與先天性小耳畸形相關(guān)性研究

馮濤錢(qián)瑾王冰清王悅章慶國(guó)

1張家口市婦幼保健院兒科(張家口075000)

2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院(北京100144)

先天性小耳畸形（microtia）是一種由不明原因引起的胚胎第一、二鰓弓和第一鰓溝的發(fā)育異常，從而導(dǎo)致耳郭先天性發(fā)育不良，常常伴有外耳道閉鎖、中耳及頜面部畸形[1]。研究資料顯示，先天性小耳畸形在我國(guó)的發(fā)病率為2．25/萬(wàn)左右，是僅次于唇腭裂的第二大顱面部先天畸形疾病[2-5]。先天性小耳畸形發(fā)病率男性明顯高于女性，但遺傳學(xué)研究并未發(fā)現(xiàn)性染色體異常。先天性小耳畸形臨床表現(xiàn)為外耳形態(tài)改變，外耳郭基本結(jié)構(gòu)消失或部分消失，僅有殘余耳軟骨及部分耳垂，甚至完全沒(méi)有上述結(jié)構(gòu)，而且伴有外耳道閉鎖或狹窄、中耳畸形等癥狀。擴(kuò)張皮瓣法中段耳廓再造[6]及蘇氏定位法[7]等應(yīng)用于先天性小耳畸形患者耳廓再造手術(shù)。報(bào)道顯示60．4%的病例為多發(fā)畸形，3．1%的病例為綜合征[8]，主要有Branchio-oto-renal、Treacher Collins、CHARGE綜合征等。非綜合征型小耳畸形遺傳機(jī)制的揭示遠(yuǎn)不如綜合征型小耳畸形[9-10]。小耳畸形的發(fā)病機(jī)制目前仍不十分明確，存在“神經(jīng)嵴細(xì)胞擾亂”和“局部缺血”假說(shuō)，最新研究表明神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育異常在小耳畸形的發(fā)病中起關(guān)鍵作用[3]。我們主要針對(duì)導(dǎo)致小耳畸形發(fā)生的遺傳因素進(jìn)行研究，認(rèn)為血管發(fā)育異?？赡軐?dǎo)致局部缺血。

小耳畸形是一種環(huán)境及基因因素共同導(dǎo)致的發(fā)育異常，一些基因?qū)ε咛r(shí)期的頜面部及聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育起至關(guān)重要的作用[1,3]。目前已鑒定的小耳畸形風(fēng)險(xiǎn)基因多為調(diào)控胚胎期發(fā)育的基因，如HOXA2，F(xiàn)GF3，SIX2，HMX1等[11-14]。這些基因大都屬于同源盒基因（homeobox gene）家族，它們是控制胚胎發(fā)育的主要基因，對(duì)器官發(fā)生和細(xì)胞分化調(diào)控起關(guān)鍵作用。同源盒基因家族具有進(jìn)化上高度保守序列，長(zhǎng)約180bp，分散于基因的3’端。該保守序列編碼的60個(gè)氨基酸可形成HLH(he?lix-loop-helix)結(jié)構(gòu)來(lái)激活或抑制靶基因表達(dá)[15]。同源盒基因在胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化具有調(diào)控作用[16]。MEOX2基因是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一同源盒基因，其編碼的蛋白是核轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活或抑制其下游基因的表達(dá)[17]。MEOX2基因主要在血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，其過(guò)表達(dá)可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖[18]。研究表明MEOX2與低氧性肺動(dòng)脈高壓、門(mén)靜脈高壓、阿爾茨海默病、早年衰老綜合征、唇腭裂等的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[19-21]。研究顯示MEOX2基因?qū)M織細(xì)胞有負(fù)性調(diào)控作用，MEOX2基因?qū)υ鲋臣?xì)胞的抑制作用首先發(fā)現(xiàn)于平滑肌，其作用機(jī)理可能是通過(guò)p53非依賴(lài)性方式激活細(xì)胞周期來(lái)抑制性蛋白p21。在促血管形成生長(zhǎng)因子刺激下，MEOX2能抑制內(nèi)皮細(xì)胞向血管生成表型的轉(zhuǎn)化，對(duì)血管形成有負(fù)調(diào)控作用，其主要是通過(guò)抑制核因子kappaB依賴(lài)基因的表達(dá)[22]，但與先天性小耳畸形的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。

同源盒基因家族的多個(gè)成員已被證實(shí)為小耳畸形的風(fēng)險(xiǎn)致病因素。為了證實(shí)MEOX2這一同源盒基因是否參與了小耳畸形這一顱面部先天畸形的發(fā)生，我們采用候選基因關(guān)聯(lián)研究策略對(duì)收集的328例小耳畸形患者和500例對(duì)照進(jìn)行了分析。深入研究與先天性小耳畸形發(fā)病密切相關(guān)的候選基因，對(duì)于闡明其發(fā)病機(jī)制及防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1樣本采集

小耳畸形樣本收集于張家口市婦幼保健院以及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院，包括小耳畸形患者樣本（328例）和健康對(duì)照樣本（500例），所有樣本在3代內(nèi)無(wú)親緣關(guān)系。疾病表型鑒定采用Naga?ta分型標(biāo)準(zhǔn)，包括耳甲腔型82例，臘腸型201例，耳垂型45例。其中男性246例（75%），右側(cè)發(fā)生的患者197例（60%）。

1.2 標(biāo)簽SNP（單核苷酸多態(tài)性）位點(diǎn)挑選

下載千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www．ncbi．nlm．nih．gov/variation/tools/1000genomes/）漢 族 人 群（CHB）的MEOX2基因以及上下游各10kb內(nèi)所有變異位點(diǎn)。挑選標(biāo)簽SNP時(shí)，我們保留了最小等位基因頻率＞0．01的常見(jiàn)變異位點(diǎn)。使用Haploview軟件挑選標(biāo)簽SNP，具體參數(shù)為：r2閾值為0．6，多位點(diǎn)檢驗(yàn)LOD閾值為3．0。最后挑選了8個(gè)變異位點(diǎn)作為標(biāo)簽SNP，分別為 rs17420659、rs632846、rs10226819、rs62439069、rs10226196、rs10224052、rs79493573、rs76405124。

1.3基因分型

我們使用全血DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）完成DNA提取，使用Nanodrop對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，使用飛行質(zhì)譜（sequenom）法完成變異位點(diǎn)的基因分型，該工作由北京康普森生物技術(shù)有限公司完成，分型工作嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行。

1.4數(shù)據(jù)分析

對(duì)于獲得基因分析結(jié)果，在病理和對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)丟失率存在差異的位點(diǎn)，同時(shí)對(duì)所有位點(diǎn)的對(duì)照樣本進(jìn)行了Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)后未發(fā)現(xiàn)P＜0．05的位點(diǎn)，提示樣本為隨機(jī)采樣所得。我們使用plink軟件對(duì)所有位點(diǎn)進(jìn)行l(wèi)ogistic檢驗(yàn)，并對(duì)性別和年齡以及地理來(lái)源（按照南北人群分）進(jìn)行了校正[23]。多重檢驗(yàn)校正采用Bonferroni檢驗(yàn)。我們使用SHAPEIT進(jìn)行單體型構(gòu)建，并采用Impute2進(jìn)行基因組填充（使用千人基因組計(jì)劃中的漢族人群作為背景），僅保留填充后Info值＞0．6的變異位點(diǎn)，然后使用Snptest進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，關(guān)聯(lián)分析時(shí)同樣使用了性別和年齡以及地理來(lái)源（按照南北人群分）對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正。使用 SeattleSeq（http://snp．gs．wash?ington．edu/SeattleSeqAnnotation138/）對(duì)所有變異位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋?zhuān)褂肎TEx（Genotype-Tissue Ex?pression）和 MGI（Mouse Genome Informatics）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)MEOX2基因在各個(gè)組織中表達(dá)情況進(jìn)行展示。

2 結(jié)果

2.1關(guān)聯(lián)分析

我們使用飛行質(zhì)譜法對(duì)MEOX2基因的8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，位點(diǎn)分型成功率＞99．62%，且這8個(gè)位點(diǎn)的對(duì)照數(shù)據(jù)均不背離Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，因此將8個(gè)位點(diǎn)全部納入后續(xù)的關(guān)聯(lián)研究。為了降低人群分層對(duì)關(guān)聯(lián)研究結(jié)果的影響，我們使用地理來(lái)源（按照南北人群分類(lèi)23）作為協(xié)變量對(duì)人群分層進(jìn)行校正，同時(shí)還校正了年齡和性別。關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)8個(gè)位點(diǎn)的P值均小于0．05（3個(gè)獨(dú)立檢驗(yàn)，依據(jù)見(jiàn)連鎖不平衡區(qū)塊結(jié)果），且rs76405124（P=0．006556，OR=0．82）和 rs10224052（P=0．01619，OR=0．83）的P值經(jīng)Bonferroni校正后仍然顯著（Bonferroni P＜0．05）（表1）。

2.2連鎖不平衡區(qū)塊構(gòu)建及基于單體型的關(guān)聯(lián)分析

為了進(jìn)一步揭示MEOX2基因的單體型和小耳畸形之間的關(guān)聯(lián)性，我們首先使用Haploview構(gòu)建了連鎖不平衡區(qū)塊（圖1），rs17420659、rs632846、rs10226819落入Block1（83kb）連鎖不平衡區(qū)塊內(nèi)，rs62439069、rs10226196、rs10224052落 入 Block2（2kb）連鎖不平衡區(qū)塊內(nèi)，rs79493573、rs76405124落入Block3（20kb）連鎖不平衡區(qū)塊內(nèi)。3個(gè)連鎖不平衡區(qū)塊提示有3個(gè)有效的多重檢驗(yàn)。構(gòu)建這8個(gè)位點(diǎn)的單體型并進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)Block 3的AA單體型和小耳畸形顯著關(guān)聯(lián)（P=0．0023，Perm-P=0．0260，P＜ 0．05）（表2）。

圖1 MEOX2基因8個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)建的連鎖不平衡圖。該圖上方展示SNP位點(diǎn)間的距離關(guān)系，中間顯示的是SNP位點(diǎn)的rs編號(hào)，下方倒三角展示位點(diǎn)間的連鎖不平衡關(guān)系。使用D’反映兩兩位點(diǎn)間的連鎖不平衡關(guān)系：紅色，D’=1且LOD ≥ 2；粉色，D’＜1且LOD ≥ 2；白色，D’＜1且LOD ＜ 2；樣本數(shù)：Case vs Control=328 vs 500．Fig.1 LD constructed by 8 SNPs of MEOX2.Above of this picture shows the distance relationship between SNP sites,middle of it is the rs number and inverted triangle displays LD of SNPs.D’reflects the LD between the two sites:Red,D’=1 and LOD≥2;Pink,D’＜1 and LOD ≥2;White,D’＜1 and LOD＜2;n(Case vs Control)=328 vs 500.

表1 MEOX2基因內(nèi)8個(gè)標(biāo)簽SNP和小耳畸形的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table 1 Correlation analysis results between 8 SNPs and congenital microtia of MEOX2

2.3基因組填充及關(guān)聯(lián)分析

以千人基因組計(jì)劃的中國(guó)人群數(shù)據(jù)作為背景信息，我們使用基因組填充的方法推測(cè)出MEOX2基因內(nèi)另外18個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型信息。然后使用Snptest軟件對(duì)這所有26個(gè)（8個(gè)檢測(cè)加上18個(gè)推測(cè)）變異位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，rs71549953（P=0．0005，OR=1．96）的P值經(jīng)Bonferroni校正后仍然顯著（Bonferroni P＜0．05）（表3）。該結(jié)果證實(shí)了ME?OX2基因和小耳畸形顯著相關(guān)（Bonferroni P＜0．05）。我們使用SeattleSeq對(duì)rs71549953進(jìn)行基因注釋后發(fā)現(xiàn)這位點(diǎn)落于MEOX2基因的內(nèi)含子內(nèi)。

2.4 GTEx和MGI數(shù)據(jù)庫(kù)中MEOX2表達(dá)情況SNPMEO

圖2 MEOX2在小鼠胚胎期以及各胚層和分化器官內(nèi)的表達(dá)情況。該圖左側(cè)顯示的是小鼠胚胎分化的各個(gè)結(jié)構(gòu)組織，上方顯示的是小鼠不同胚胎發(fā)育階段，如如TS11 E7．25-8代表胚胎發(fā)育的第11個(gè)Theiler期即第7．25-8天。方框內(nèi)顯示的是各階段MEOX2基因的表達(dá)量，白色表示該階段無(wú)該組織結(jié)構(gòu)，方框內(nèi)帶圓圈表示對(duì)應(yīng)組織器官該階段無(wú)數(shù)據(jù)，藍(lán)色代表基因表達(dá)，紅色表示基因不表達(dá)，顏色的深淺反映表達(dá)量的高低（http://www．informatics．jax．org/）。Fig.2 The expression of MEOX2 in embryonic period,endoderm and differentiated organs of mice(http://www.informatics.jax.org/).The left side of the figure shows the embryonic differentiation of mouse embryos and the above shows the

表2 MEOX2基因內(nèi)8個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)建的單體型以及和小耳畸形的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table 2 Correlation analysis results between haplotype which constructed by 8 SNPs and congenital microtia of MEOX2

為了進(jìn)一步了解上述位點(diǎn)如何影響X2基因功能進(jìn)而和小耳畸形相關(guān)聯(lián)，我們將他們提交至表型和組織特異性表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Genotype-Tissue Expression，GTEx）。該數(shù)據(jù)庫(kù)并未記錄位點(diǎn)在特異性器官內(nèi)是否為eQTL位點(diǎn)，但MEOX2高表達(dá)于脛神經(jīng)和皮下脂肪（附件圖1）。考慮到MEOX2可能在胚胎早期影響器官發(fā)育，我們考察了該基因的小鼠胚胎原位雜交結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其在胚胎期，特別是在胚胎中晚期各器官分化過(guò)程中高度表達(dá)（圖2），這和頜面部器官分化發(fā)生在胚胎發(fā)育中后期相吻合。embryonic development stage of the mouse.For example,TS11 E7.25-8 represents the first theiler stage of embryonic development(7.25-8 days).The box shows the expression of the MEOX2 gene in each stage.White means there is no structure in this stage.The circle in the box indicates that there is no data in tissue organ.Blue means gene expression and red means no gene expression.The shade of color reflects the level of expression.

3 討論

先天性小耳畸形的遺傳特點(diǎn)不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，故對(duì)其遺傳分析和致病基因的定位存在一定難度[24]。小耳畸形可以作為一個(gè)獨(dú)立的出生缺陷或作為綜合征的一部分[25]。小耳畸形在我國(guó)高發(fā)，但對(duì)其遺傳發(fā)病機(jī)制的研究仍處于早期階段，相關(guān)研究已鑒定的小耳畸形相關(guān)綜合征的致病基因大約有20余個(gè)（HOXA1、TFAP2A、EYA1、SIX1、SIX5、CHD7等），全基因組關(guān)聯(lián)研究鑒定了多個(gè)小耳畸形風(fēng)險(xiǎn)基因如ROBO1，GBX2，EPAS1，NRP2，GATA3以及SEMA7A等。本文通過(guò)對(duì)同源盒家族成員MEOX2和小耳畸形進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)多個(gè)變異位點(diǎn)和我國(guó)小耳畸形顯著相關(guān)（如rs10224052 和 rs76405124）。

表3 基因組填充后的MEOX2基因內(nèi)的SNP位點(diǎn)和小耳畸形關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table 3 Correlation analysis results between 8 SNPs which genotypes filled and congenital microtia of MEOX2

目前對(duì)先天性小耳畸形的病因和表型變異性還知之甚少，然而，發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)研究表明，神經(jīng)嵴細(xì)胞功能缺陷與小耳畸形等多種顱面綜合征相關(guān)。Luquetti等[3]認(rèn)為“神經(jīng)嵴細(xì)胞紊亂”和“血管發(fā)育不良”可能為小耳畸形的病因。顱神經(jīng)嵴細(xì)胞是起源于背側(cè)神經(jīng)管的一個(gè)暫時(shí)性、可遷移、多潛能的細(xì)胞群，可以進(jìn)一步分化為前腦（Fore?brain）、中腦（Midbrain）、后腦（Hindbrain），其中，后腦的顱神經(jīng)嵴細(xì)胞進(jìn)一步分區(qū)形成數(shù)個(gè)菱腦原節(jié)（Rhombomere’r），這一結(jié)構(gòu)在顱頜面部的發(fā)育中起重要作用26。目前公認(rèn)和顱面部發(fā)育畸形相關(guān)的基因主要來(lái)自同源盒基因家族，動(dòng)物模型顯示該家族成員如Hoxa1，Hoxb1，Six1，Six4等突變可導(dǎo)致顱面畸形，甚至出現(xiàn)小耳畸形[3]。在耳郭的發(fā)育階段，胚胎受到遺傳或外界因素影響，容易出現(xiàn)耳郭的多種發(fā)育畸形。小耳畸形就是源于胚胎期第一、二鰓弓、第一咽囊、第一鰓裂和顳骨原基的顱骨結(jié)構(gòu)發(fā)育不良的一組先天性畸形。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠耳郭發(fā)育期，鐙骨動(dòng)脈破裂會(huì)引起小耳畸形，使顱神經(jīng)嵴細(xì)胞不具有遷移性[27]，而顱神經(jīng)嵴細(xì)胞能否正確遷移到指定位置，是顱頜面結(jié)構(gòu)正常發(fā)育的前提，也是各種頜面部畸形發(fā)生的重要原因[28]?！熬植咳毖笔菍?dǎo)致小耳畸形的發(fā)病的假說(shuō)之一。有研究報(bào)道畸形小鼠的咽部動(dòng)脈和舌骨動(dòng)脈交界處有同側(cè)血腫，使頭頸部血管發(fā)育受阻造成了局部缺血和壞死[29]。研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)可導(dǎo)致血管發(fā)育異常的基因如NRP2，EPAS1，ROBO1，GBX2，PLCD3和小耳畸形顯著相關(guān)。MEOX2基因?qū)儆谕春谢颍址Q(chēng)作GAX基因。MEOX2基因能調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管外膜的成纖維細(xì)胞增殖[30]，與心血管疾病有關(guān)。因此我們認(rèn)為MEOX2可能影響血管發(fā)育導(dǎo)致局部缺血，進(jìn)而造成小耳畸形。

我們的研究結(jié)果顯示rs76405124和rs10224052位點(diǎn)和小耳畸形顯著相關(guān)（Bonferroni P＜0．05），基因注釋顯示rs71549953落于MEOX2基因的內(nèi)含子內(nèi)，另外，MEOX2高表達(dá)于脛神經(jīng)和皮下脂肪，因此我們推測(cè)MEOX2基因還可能影響顱頜面部皮下脂肪表達(dá)，從而導(dǎo)致耳發(fā)育畸形，但這需要功能研究的證實(shí)。

附件圖1 表型和組織特異性表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)記錄的MEOX2表達(dá)情況Attachment Fig.1 Phenotype and expression of the MEOX2 which was recorded by tissue specificity of database

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