降鈣素原的原核表達(dá)及鑒定

蔣棚俊，吳勝昔，王玲玲，李令臣，李俊萱，曾 政，梁望旺，李 志

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054； 2.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心， 重慶 401120)

降鈣素原是由116個氨基酸組成的多肽，相對分子質(zhì)量約為13 KD。它是一種糖蛋白，且無激素活性，其前肽物質(zhì)是降鈣素[1-3]。大多數(shù)專家和學(xué)者都認(rèn)為PCT可能是一種內(nèi)源性非類固醇類抗炎物質(zhì)[4-5]，正常人群體內(nèi)的血漿PCT水平小于0.1 ng/mL[6]。患者在局部感染、病毒性感染時，血漿PCT水平一般不會發(fā)生變化。只有在患嚴(yán)重型全身性細(xì)菌感染、膿毒癥等疾病時患者體內(nèi)的血漿PCT水平才會出現(xiàn)明顯上升。PCT的特異性較高，可應(yīng)用于各種臨床癥狀的鑒別及診斷[7-8]。在患者體內(nèi)血液中，PCT的半衰期為 25～30 h[9]，由此可見PCT的半衰期很短。1993年，PCT作為細(xì)菌感染的早期標(biāo)志物在國外被首次報道[10]。目前PCT作為一個新的生物指標(biāo)應(yīng)用于檢測感染炎癥的程度,已廣泛運用于細(xì)菌性感染和膿毒癥的檢測。2001年，PCT作為一種診斷指標(biāo)被國際膿毒癥會議指定在膿毒癥診斷中使用[11-13]。目前PCT被廣泛應(yīng)用于臨床檢測以及指導(dǎo)抗生素用藥，但PCT檢測試劑均依賴進(jìn)口，價格比較昂貴。PCT檢測試劑盒的關(guān)鍵試劑是能與PCT蛋白特異性結(jié)合的PCT單克隆抗體，但制備高效價、特異性強(qiáng)的抗體必須具有免疫原性強(qiáng)的PCT抗原，因為PCT在人血液含量極低且半衰期短，無法采用提取的方式獲得，而化學(xué)合成PCT蛋白價格非常昂貴，因此本研究擬采用基因工程方法表達(dá)PCT蛋白。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

所用大腸桿菌為BL21(DE3)、pET28a(+)質(zhì)粒，重慶理工大學(xué)生物制藥實驗室保存；top10甘油菌、pET28a(+)/PCT重組質(zhì)粒，購自上海生工生物有限公司，并測序。

1.2 實驗試劑

DNA Marker，購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白質(zhì)Marker，購自Thermo Scientific公司；HRP-羊抗小鼠IgG，購自北京鼎國昌盛生物有限公司；His-tag組氨酸單抗，購自美國Sigma公司。

1.3 pET28a(+)/PCT質(zhì)粒的構(gòu)建

通過NCBI查找PCT全基因序列，并對PCT基因序列進(jìn)行優(yōu)化，采用化學(xué)合成方法合成PCT基因，由上海生工進(jìn)行測序。設(shè)計酶切位點(NcoI和XhoI)以及采用pET28a(+)作為表達(dá)載體。

1.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

取少量top10甘油菌于LB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素)，搖床培養(yǎng)過夜，菌液采用質(zhì)粒提取試劑盒提取PCT重組質(zhì)粒并測定提取質(zhì)粒的濃度。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，重組感受態(tài)細(xì)胞接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，將各培養(yǎng)試管按IPTG濃度梯度(0.1、0.5、1 mmol/L)和溫度梯度(16、25、37 ℃)以及時間梯度(6、8、10、12 h)進(jìn)行PCT重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎，離心，將離心所得的沉淀用適量的滅菌水溶解，煮樣，將樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析確定PCT蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件。

1.5 重組蛋白的純化及鑒定

按優(yōu)化得到的最佳條件大規(guī)模進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，采用His-tag鎳柱純化重組PCT蛋白，收集純化所得產(chǎn)物，煮樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.6 蛋白質(zhì)印記(Western blot)分析

將誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗滌3次；以His-tag組氨酸單抗為一抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次；以羊抗鼠IgG-HRP為二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加適量的化學(xué)發(fā)光液，紅外光掃描儀成像。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 重組載體的構(gòu)建及鑒定

將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(NcoI和XhoI)鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示，在362 bp處有一的特異性條帶，如圖1所示。由圖1可以得出：酶切DNA片段大小為362 bp，符合預(yù)期的結(jié)果。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pET28a-PCT的雙酶切產(chǎn)物

2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

2.2.1 重組蛋白誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

在不同溫度(16，25，37 ℃)誘導(dǎo)所得產(chǎn)物進(jìn)行超聲破菌，沉淀用適量的滅菌水溶解，沉淀和上清用SDS-PAGE電泳進(jìn)行檢測，可見在17 kD有一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期大小相一致，說明pET28a(+)/PCT成功表達(dá)，如圖2所示。由圖2可以得出：25 ℃蛋白表達(dá)量較高，可作為后續(xù)誘導(dǎo)條件。

M.蛋白Marker; 3.空載體; 4.16 ℃誘導(dǎo)上清； 5.16 ℃誘導(dǎo)沉淀; 6.25 ℃誘導(dǎo)上清；7.25 ℃誘導(dǎo)沉淀; 8.37 ℃誘導(dǎo)上清； 9.37 ℃誘導(dǎo)沉淀

圖2 不同溫度誘導(dǎo)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物

2.2.2 重組蛋白誘導(dǎo)劑量的優(yōu)化

將25 ℃條件下，使用不同濃度IPTG(0.1、0.5、1 mmol/L IPTG)誘導(dǎo)PCT重組蛋白表達(dá)，所得產(chǎn)物進(jìn)行超聲破菌，沉淀用適量的滅菌水溶解，沉淀和上清用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以得出：在25 ℃條件下，IPTG濃度為0.5 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，蛋白表達(dá)量最大。

M.蛋白Marker；1.空載體; 2. 0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)上清; 3. 0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)沉淀；4. 0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)上清； 5. 0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)沉淀； 6. 1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)上清；7. 1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)沉淀

圖3 25 ℃不同濃度IPTG誘導(dǎo)結(jié)果

2.2.3 重組蛋白誘導(dǎo)時間的優(yōu)化

將25 ℃條件下，在不同時間(6、8、10、12 h)對0.5 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，所得產(chǎn)物進(jìn)行超聲破菌，沉淀用適量的滅菌水溶解，沉淀和上清用SDS-PAGE電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以得出：在25 ℃條件下，IPTG濃度為0.5 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)12 h時，蛋白表達(dá)量最高。

1.空載體；M.蛋白Marker；3.25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 6 h誘導(dǎo)沉淀; 4.25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 6h誘導(dǎo)上清；5. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 8 h誘導(dǎo)沉淀; 6.25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 8 h誘導(dǎo)上清；7. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 10h誘導(dǎo)沉淀; 8. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 10 h誘導(dǎo)上清；9. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 12 h誘導(dǎo)沉淀；10. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 12 h誘導(dǎo)上清

圖4 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG不同誘導(dǎo)時間誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物

2.3 重組蛋白的純化及鑒定

2.3.1 重組蛋白的純化

利用重組蛋白攜帶的His-tag與Ni特異性結(jié)合的原理，采用不同濃度咪唑(50、100、200、300、400、500 mmol/L)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫下來的蛋白。

2.3.2 重組蛋白純化結(jié)果的鑒定

將純化所得的蛋白洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以得出：100 mmol/L咪唑洗脫得到的蛋白相對分子質(zhì)量大小為17 kD，與理論值相符合，100 mmol/L咪唑洗脫液可作為后續(xù)實驗洗脫濃度。

M.蛋白質(zhì)Marker;1.空載體；2.流穿液；3.雜蛋白；5～7.100 mmol/L咪唑洗脫液

2.4 重組蛋白的蛋白質(zhì)印記分析

將純化所得的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再轉(zhuǎn)膜，使用抗His-tag組氨酸單抗作為一抗，對PCT重組蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：在17 kD處有明顯的蛋白印跡條帶，而空載體在對應(yīng)位置無任何條帶，與預(yù)期結(jié)果相符合。通過Western blot可以看出，PCT重組蛋白的特異性較好。

1.純化所得PCT重組蛋白；2.空載體

3 結(jié)束語

近年來，降鈣素原在人體炎癥中的作用機(jī)理已廣泛引起了眾多專家和學(xué)者的重視，特別是在全身性炎癥反應(yīng)、膿毒癥和細(xì)菌性感染領(lǐng)域。健康人體在感染炎癥后，患者體內(nèi)的血漿PCT水平會在早期(2～3 h)發(fā)生迅速升高,因此PCT具有早期臨床診斷價值[14]。

PCT在血液中的半衰期較短，無法通過提取的方式大量獲得PCT蛋白，而通過化學(xué)方法合成PCT蛋白的成本過高，因此本文通過研究PCT的原核表達(dá)大量制備PCT蛋白具有重要意義。本研究選擇PET28a(+)為表達(dá)載體，在制定PCT全基因合成方案的時候，在N端引入一個His-tag，方便后續(xù)的純化工作。本研究使用成功構(gòu)建的PET28a(+)/PCT重組質(zhì)粒導(dǎo)入的top10甘油菌，提取PET28a(+)/PCT重組質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。設(shè)置了不同溫度、不同誘導(dǎo)劑劑量、不同誘導(dǎo)時間優(yōu)化PCT重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，篩選出的轉(zhuǎn)化后的PCT工程菌在25 ℃、0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h時蛋白表達(dá)量最大，可作為大批量誘導(dǎo)表達(dá)的條件。利用His-tag親和層析純化大批量誘導(dǎo)的PET28a(+)/PCT重組蛋白，收集純化得到的重組蛋白，采用SDS-PAGE電泳、Western blot分別對重組蛋白的純度及特異性進(jìn)行了鑒定，電泳結(jié)果顯示：純化后的PCT重組蛋白有較高的純度，特異性良好。本研究獲得的重組PCT蛋白將為后續(xù)開展PCT單克隆抗體的制備以及檢測方法的研究提供良好的試劑。

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