間充質干細胞源性外泌體提取鑒定方法研究

楊 前 甘國勝 袁紫林 王 剛 陳 力 閆德祺 張 宜 刁 波

(中國人民解放軍武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗科 武漢 430000)

干細胞外泌體是MSCs在病理或者生理狀態(tài)下分泌的直徑約30～100 nm的膜性小囊泡，含有蛋白質、mRNA等活性成分，有研究表明干細胞外泌體能一定程度上模擬MSC的生物學功能，具有廣闊的應用前景[1～2]。本課題將應用二次提取法提高外泌體的純度，為準確的開展其他實驗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

CD31、CD73、CD29、CD81、CD63(BD); 外泌體提取試劑盒(invitrogen);高速離心機(Sigma); FACsAria流式細胞儀 (BD)；透射電鏡(Philips)。

1.2 臍帶間充質干細胞培養(yǎng)及鑒定

無菌操作將臍帶剪碎，分離出沃頓膠，接種至培養(yǎng)皿中，加入干細胞培養(yǎng)基，待細胞集落長滿后，消化傳代；取狀態(tài)良好的P3代細胞懸液50μl，加入10μlCD31、CD73、DRPerCP及5μlCD29，避光孵育15min,1000r/min，離心5min,沉淀500μlPBS重懸，流式檢測。

1.3 干細胞外泌體提取

將MSCs無血清空培養(yǎng)24h，取5ml上清，2000G離心30min，取上清，加入1/2體積外泌體提取液，4 ℃過夜，第2天10000G，4 ℃離心60min，取部分沉淀，凝膠電泳及BCA檢測；剩余沉淀重懸PBS中，再次加入1/2體積外泌體提取液，4℃靜置12H及24H，10000G，4 ℃離心60min，棄上清，再次取出部分沉淀凝膠電泳及BCA檢測，其余-80℃凍存。

1.4 凝膠電泳法及BCA蛋白定量法檢測外泌體純度及濃度

分別將兩次提取的蛋白樣品用上樣緩沖液稀釋，沸水浴5min，灌膠，上樣，并加入20μl蛋白Marker對照，電泳(2～3H)；染色4～6h；脫色；凝膠攝像分析；同時將適量兩次次提取的樣品液加入96孔板中，標準品稀釋至20μl；各孔加入200μl BCA工作液,37℃避光20min；562nm，測OD值；計算蛋白濃度。

1.5 電鏡觀察外泌體形態(tài)

取外泌體懸液20μl，滴于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1min，自然干燥，滴加20g/L磷鎢酸負染1min,濾紙吸干殘留液，白熾燈下烤10min，電鏡觀察拍照。

1.6 流式檢測外泌體

將20 μl CD63和5μlCD81加入100μl外泌體懸液中，混勻，4 ℃避光孵育30min，用同型不加抗體的外泌體懸液作陰性對照，流式檢測。

2 結果

2.1 huc-MSCs流式檢測

臍帶干細胞呈現(xiàn)CD73(+)、CD29(+)、CD31(-)、HLA-DR-Per-CP(-)純度和活性都比較高的特征(圖1)。

圖1 huc-MSCs表面標志物流式檢測

2.2 凝膠電泳法及BCA蛋白定量法檢測蛋白純度及濃度

外泌體經(jīng)一次提取后，雜蛋白條帶非常多，純度低，而二次提取后雜蛋白少了很多，純度提高(圖2)；QuantityOne軟件分析得出蛋白條帶灰度值(圖2-C)；GraphPad Prism 7 軟件分析數(shù)值并計算得出一次提取與二次提取12H及24H(P<0.01)，均存在顯著性差異(圖2-D)；BCA蛋白定量法得出，一次提取后外泌體蛋白含量為15.49ug/ml；二次提取后平均含量為3.48ug/ml；雜蛋白去除，外泌體純度提高。

2.3 間充質干細胞外泌體電鏡觀察

MSCs外泌體呈圓形或橢圓形的小囊泡，囊泡外周可見膜性結構，大小具有較明顯的異質性，直徑為30～100nm，腔內部顯示低電子密度成分(圖3)。

2.4 間充質干細胞外泌體流式檢測

MSCs外泌體空白對照組沒有檢測出CD63、CD81蛋白，實驗組則高表達CD63、CD81蛋白(圖4)。

A

B

C

D

注：A圖表示一次提取后，1、2、3、4四個重復樣本雜蛋白條帶都非常多；B圖二次提取電泳圖，1、2、3圖是加入提取液靜置12H， 4、5、6是靜置24H，雜蛋白條帶明顯降低。

圖3 外泌體電鏡形態(tài)

A 空白對照

B huc-MSC外泌體

3 討論

MSCs是一類具有自我復制及多向分化潛能的祖細胞，具有組織修復、免疫調節(jié)等作用，為當今自然科學領域研究的熱點問題。以往總認為其治療潛能是由于MSC歸巢分化、替代原來的損傷組織，直至2010年Lai等[3]通過分離MSC以內分泌和旁分泌的方式分泌的起修復作用的營養(yǎng)因子，首次證實為MSCs外泌體。有研究證實外泌體參與一系列生物過程，如免疫應答、血管生成、炎癥反應、抗原提呈等[4]，在減少心肌損傷、促進心血管再生、調節(jié)免疫系統(tǒng)、促進神經(jīng)再生等方面有重要作用[5]。由此可見準確的提取鑒定外泌體的方法尤為重要，本課題應用試劑盒二次提取純化外泌體，大大提高外泌體的純度，為準確開展后續(xù)實驗研究提供有力科學依據(jù)。

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2 Huang L,Ma W,Ma Y,et al．Exosomes in Mesenchymal Stem Cells,a New Therapeutic Strategy for Cardiovascular Diseases.Int J Bid Sci,2015,11(2):238～245.

3 Lai RC,ArsIan F,Lee MM,et al.Exosome Secreted by MSC Reduces Myocardial Ischemia Reperfusion Injury.Stem Cell Res,2010,4(3):214～222.

4 Sun L,Xu R,Sun X,et al.Safety Evaluation of Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stromal Cell.Cytotherapy,2016,18(3):413～422.

5 Kariminekoo S,Movassaghpour A,et al.Implications of Mesenchymal Stem Cells in Regenerative Medicine.Artif Cells Nanomed Biotechnol,2016,44(3):749～757.