BRAF基因突變與甲狀腺微小乳頭狀癌生物學(xué)特性的關(guān)系△

章美武 張 燕 范曉翔 毛達(dá)峰 黃品同

(溫州醫(yī)科大學(xué)研究生院 溫州 325035)

近幾年對(duì)甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)分子發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌基因同源體B1(V-Raf Murine Sarcoma viral Oncogene Homolog B1，BRAF)突變是PTC最常見(jiàn)的基因變化，目前認(rèn)為PTC的發(fā)生、發(fā)展主要與BRAF基因突變密切相關(guān)。近年來(lái)甲狀腺癌的患病率顯著增加，其中以甲狀腺微小乳頭狀癌(papillary thyroid microcarcinoma，PTMC)的增長(zhǎng)為主且增速最快。2014 年WHO公布的全球癌癥報(bào)告指出，甲狀腺癌新發(fā)病例中超過(guò)50%為PTMC[1]。目前關(guān)于BRAF基因突變與PTMC的關(guān)系的報(bào)道比較少。本研究旨在探討B(tài)RAF基因突變與PTMC生物學(xué)特性的關(guān)系，為臨床診斷和治療提供幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2016年8月～2018年2月在我院介入科行超聲引導(dǎo)下甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺，同時(shí)行FNAB(fine needle aspiration biopsy，F(xiàn)NAB)和BRAF V600E基因突變檢測(cè)，并在我院行甲狀腺手術(shù)治療,所有患者均接受至少一側(cè)腺葉+峽部切除或全甲狀腺切除術(shù)，所有病例均接受中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃，對(duì)疑有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腺外侵犯者，行功能性頸側(cè)區(qū)清掃。最終收集手術(shù)病理結(jié)果為PTMC患者共211例，其中女158例，男53例，患者年齡19～70歲，平均(43.6±11.8)歲；甲狀腺穿刺結(jié)節(jié)直徑0.1～1.0cm，平均(0.60±0.19)cm，≤0.5cm 81例，>0.5cm 130例。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前行FNAB和BRAF基因檢測(cè)甲狀腺部位與術(shù)后手術(shù)病理位置不一致者；(2)術(shù)后病理PTMC伴有PTC；(3)術(shù)后病理為髓樣癌、濾泡狀癌等非甲狀腺微小乳頭狀癌；(4)資料不全者。

1.2 儀器和方法

應(yīng)用Esaote My Lab90型超聲診斷儀，配備LA523探頭。常規(guī)超聲掃查甲狀腺可疑病灶，記錄其大小、解剖部位、上下位置、內(nèi)外位置、深淺位置、鈣化、縱橫比、回聲、邊界等超聲特征，并進(jìn)行細(xì)針穿刺，將穿刺針內(nèi)的細(xì)胞推注入細(xì)胞液基瓶(ThinPrep PreservCyt ? Solution)內(nèi)用于BRAF基因檢測(cè)。

BRAF V600E基因檢測(cè)方法：為杭州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)項(xiàng)目，DNA提取和DNA擴(kuò)增分別采用組織提取試劑盒和巢式PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化，最后采用Sequencer軟件進(jìn)行初步分析，確定突變類(lèi)型和突變位點(diǎn)。只有雙向測(cè)序結(jié)果顯示存在突變時(shí)，突變結(jié)果方可確認(rèn)并報(bào)告(圖1)。

A BRAF V600E測(cè)序?yàn)橐吧?，未發(fā)生突變

B BRAF V600E測(cè)序?yàn)橥蛔冃停瑱z測(cè)到突變

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，BRAF V600E基因突變與 PTMC 患者生物學(xué)特性之間的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

211例PTMC中，BRAF V600E基因突變率約67.3%。男性73.6%，女性65.2%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.260)，但男性略高于女性。年齡<45歲組70.9%，≥45歲組62.8%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.208)。病灶直徑≤0.5cm和>0.5cm組BRAF突變率分別為59.3%和72.3%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)，直徑>0.5cm組突變率高于≤0.5cm者。對(duì)比解剖部位，腫瘤發(fā)生于右葉、左葉和峽部的突變率分別為 60.6%、71.1%和86.7%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.061)，但峽部的突變率要高于其他組別。無(wú)論是上下位置，還是深淺位置和內(nèi)外位置，BRAF突變各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但峽部的突變率要高于其他組別。單發(fā)與多灶腫瘤BRAF的突變率分別為63.2%和86.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。甲狀腺微小乳頭狀癌常常伴有鈣化，在211例中，無(wú)鈣化者125例(59.2%)，有鈣化者86例(40.8%)。無(wú)鈣化組BRAF突變率為73.6%，有鈣化組BRAF突變率為58.1%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。超聲檢查中比較有特征的縱橫比，縱橫比≤1和>1，兩組突變率分別為71.4%和61.2%，與BRAF基因突變無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.119)。在本組病例中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者83例(39.3%)，發(fā)生BRAF突變?yōu)?0例(72.3%)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移128例(60.7%),BRAF基因突變82例(64.1%),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.213)，見(jiàn)表1。

3 討論

BRAF V600E基因突變主要發(fā)生于 PTC中，而在甲狀腺癌的其他類(lèi)型以及甲狀腺良性腫瘤中很少見(jiàn)。BRAF突變最主要是BRAF V600E點(diǎn)突變，可致使BRAF蛋白結(jié)構(gòu)中V600E的氨基酸突變，從而使BRAF激酶發(fā)生持續(xù)性活化，激活絲裂原活化蛋白激酶通路，從而導(dǎo)致癌變。PTC中BRAF基因的突變率約為45%,PTMC中的BRAF突變率略低一些，為15%～38%[2]。本研究中BRAF V600E基因突變?cè)赑TMC中的占67.3%，突變率高可能與本研究病例選擇有關(guān)。

表1 BRAF V600E突變與PTMC臨床病理特征的關(guān)系

項(xiàng)目例數(shù)(個(gè))BRAR野生BRAF突變突變率(%)P值性別男53143973.6女1585510365.20.260年齡<45117348170.9≥4594355962.80.208直徑≤0.5cm81334859.3>0.5cm130369472.30.049部位右葉99396060.6左葉97286971.1峽部1521386.70.061位置(上下)上極42132969.0 中部107327570.1 下極47222553.2 峽部1521386.70.059位置(深淺)淺部92326065.2深部104356966.3峽部1521386.70.201位置(內(nèi)外)內(nèi)側(cè)99306969.7外側(cè)97376061.9峽部1521386.70.104病灶單發(fā)1746411063.2 多灶3753286.50.006鈣化無(wú)鈣化125339273.6有鈣化86365058.10.019縱橫比≤1126369071.4>185335261.20.119淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)128468264.1有83236072.30.213

關(guān)于BRAF V600E 基因突變與PTC的生物學(xué)特性關(guān)系的研究報(bào)道間有較大爭(zhēng)議。大多數(shù)國(guó)內(nèi)外研究[3～4]認(rèn)為BRAF基因突變與多項(xiàng)臨床病理指標(biāo)相關(guān)，如患者年齡、腫瘤大小、被膜外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤疾病分期等，但也有很多研究[5]不支持這個(gè)結(jié)論。BRAF V600E基因突變與PTMC生物學(xué)特性關(guān)系的研究報(bào)道較少，也是相互矛盾的。本研究中BRAF V600E基因突變與PTMC患者的性別、年齡、解剖部位、位置上下、位置深淺、位置內(nèi)外和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面無(wú)相關(guān)性，但與PTMC病灶的大小和多灶性相關(guān)。不同樣本大小以及研究中各種混雜因素可能是導(dǎo)致各個(gè)研究結(jié)果不一致的原因。

PTMC病灶無(wú)論是在不同的解剖位置，還是在不同的上下位置、深淺位置和內(nèi)外位置，BRAF V600E基因突變無(wú)顯著性差異，但位于峽部的突變率要高于其他組別，對(duì)于位于峽部的PTMC要密切重視。對(duì)于PTMC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與BRAF V600E突變關(guān)系，本組病例未顯示相關(guān)性，與很多研究[6]不符，可能跟在本組病例中BRAF V600E基因突變?cè)谟辛馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組都比較高，普遍比文獻(xiàn)組高有關(guān)。有一項(xiàng)Meta分析研究[7]認(rèn)為腫瘤直徑≥0.5cm時(shí)，中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率更高。在本組研究中，病灶直徑>0.5cm組BRAF突變率72.3%明顯高于≤0.5cm組的59.3%，可以肯定的是，病灶直徑越大其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)越高。多灶PTMC患者BRAF V600E基因突變率為86.5%，與單灶患者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。多灶性PTMC患者癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的侵襲性，多癌灶患者更容易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[8]，但也有相反報(bào)道，認(rèn)為沒(méi)有相關(guān)性[9]。

國(guó)內(nèi)外有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于 BRAF V600E基因突變與PTC超聲特征的關(guān)系。Kabaker 等[10]提出與 BRAF V600E基因突變相關(guān)的超聲特征有: 縱橫比>1、邊界欠清、低回聲、微鈣化、無(wú)聲暈，有3 項(xiàng)及以上超聲特征預(yù)測(cè) BRAF基因突變的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)82%。也有研究[11]認(rèn)為BRAF突變與鈣化、縱橫比、內(nèi)部回聲、邊界等超聲特征無(wú)關(guān)，因?yàn)榇嬖谌藶橹饔^因素。本組研究選取相對(duì)客觀的兩個(gè)超聲特征：縱橫比和鈣化，結(jié)果顯示BRAF V600E基因突變與PTMC的縱橫比無(wú)關(guān)，與鈣化有相關(guān)性，無(wú)鈣化組較鈣化組有較高的BRAF V600E基因突變率，但與以往研究結(jié)果[12]不一致，認(rèn)為鈣化與BRAF突變呈正相關(guān)。

本研究是回顧性研究，存在選擇偏倚等局限性；其次，本研究選擇了部分PTMC的生物學(xué)特性參數(shù)進(jìn)行分析，還存在其他因素未分析；再次，本研究只關(guān)注淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有無(wú)，未進(jìn)一步觀察頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多少及分區(qū)與BRAF基因發(fā)生突變與否無(wú)顯著相關(guān)性。

總之，PTMC中BRAF V600E基因突變與PTMC患者的性別、年齡、解剖部位、位置上下、位置深淺、位置內(nèi)外、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和縱橫比等方面無(wú)相關(guān)性，但與PTMC的病灶的大小、多灶性、鈣化相關(guān)。BRAF V600E突變檢測(cè)在PTMC中的危險(xiǎn)預(yù)測(cè)作用仍需進(jìn)一步探索。

1 苗蔚.第十五個(gè)世界癌癥日到來(lái)及《世界癌癥報(bào)告》發(fā)表.中華醫(yī)學(xué)雜志,2014,94(12):888.

2 Chen Y,Sadow P M,Suh H,et al.BRAF (V600E) is Correlated with Recurrence of Papillary Thyroid Microcarcinoma:A Systematic Review,Multi-institutional Primary Data Analysis,and Meta-analysis.Thyroid,2016,26(2):248～255.

3 盛今東,鄧建華,趙治艷,等.BRAF V600E突變及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與甲狀腺乳頭狀癌甲狀腺外侵犯的關(guān)系.腫瘤研究與臨床,2016,28(11):725～728.

4 Pelizzo M R,Dobrinja C,Casal Ide E,et al.The Role of BRAF (V600E) Mutation as Poor Prognostic Factor for the Outcome of Patients with Intrathyroid Papillary Thyroid Carcinoma.Biomed Pharmacother,2014,68(4):413～417.

5 林維浩,馬浙夫,夏浩明.甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E突變表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性研究.吉林醫(yī)學(xué),2015,36(14):2990～2993.

6 Sun Y,Shi C,Shi T,et al.Correlation between the BRAF (V600E) Gene Mutation and Factors Influencing the Prognosis of Papillary Thyroid Microcarcinoma.Int J Clin Exp Med,2015,8(12):22525～22528.

7 Liu Z,Wang L,Yi P,et a1.Risk Factors for Central Lymph Node Metastasis of Patients with Papillary Thyroid Microcarcinoma:A Meta-analysis.Int J Clin Exp Pathol,2014:7(3):932～937.

8 張磊,楊進(jìn)寶,樊宇芳,等.cN0甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素分析.中國(guó)癌癥雜志,2016,26(1):73～79.

9 Basolo F,Torregrossa L,Giannini R,et al.Correlation Between the BRAF V600E Mutation and Tumor inVasiveness in Papillary Thyroid Carcinomas Smaller than 20 Millimeters:Analysis of 1060 Cases.J Clin Endocrinol Metab,2010,95(9):4197～4205.

10 Kabaker AS,Tublin ME,Nikiforov YE,et al.Suspicious Ultrasound Characteristics Predict BRAF V600E-positive Papillary Thyroid Carcinoma.Thyroid,2012,22(6):585～589.

11 羅志艷,洪玉蓉,聞卿,等.甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E突變與其超聲特征的相關(guān)性研究.中華超聲影像學(xué)雜志,2016,25(9):785～789.

12 張玉潔,劉寶國(guó),趙治艷,等.甲狀腺乳頭狀癌中BRAF基因突變與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及臨床意義.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,48(3):502～505.