烏及丸的質(zhì)量控制方法研究

趙 昕,張 鵬，黃 娜，王東風(fēng)，陳明明*，許志偉

0 引言

烏及丸是解放軍第205醫(yī)院配制的非標(biāo)準(zhǔn)制劑，由白芍、白及、高良姜、甘草、延胡索、海螵蛸、香附等藥味組成，有溫中散寒、行氣止痛、制酸止血的功效，用于慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍、胃酸過多等癥，在臨床上療效滿意。為保證臨床用藥有效、安全，對本研究烏及丸進(jìn)行了質(zhì)量控制研究，制定了烏及丸的檢驗(yàn)方法,制訂后的定性定量方法可控制烏及丸的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀： LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津)；KQ3200E型昆山超聲波處理器。電子分析天平(120D型，北京島津公司)；對照藥材(中檢院，延胡索： 110726-201414；高良姜：121263-201304)；對照品(中檢院，甘草次酸：110723-201413；芍藥苷：供含量測定用，110736-201438)；烏及丸(由解放軍第205醫(yī)院提供，批號：20141120、20141204、20141218)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)，乙腈(色譜純，Sigma公司)，磷酸(分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)，重蒸水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

2.1.1 海螵蛸 顯微鏡下可見透明碎片呈不規(guī)則形狀且其上有網(wǎng)狀或點(diǎn)狀紋理。見圖1。

圖1 不規(guī)則透明碎片(海螵蛸)

2.1.2 高良姜 置顯微鏡下淀粉粒棒槌形、腎形或菱角形，有的中部突出作分枝狀，長約至50 μm，稀有更長的，臍點(diǎn)點(diǎn)狀、短縫狀或不明顯。見圖2。

圖2 淀粉粒(高良姜)

2.1.3 白及 置顯微鏡下觀察：表皮細(xì)胞觀垂周壁波狀彎曲，略增厚。見圖3。

圖3 表皮細(xì)胞(白及)

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 延胡索[1]取烏及丸1丸，剪碎，加硅藻土適量研磨成粉末，加濃氨試液適量使?jié)櫇瘢佣燃淄?0 ml加熱回流1 h，放至室溫，過濾，濾液蒸干，加二氯甲烷1 ml使溶解，作為供試品溶液；另取延胡索對照藥材粉末約2 g，按供試品溶液制備方法操作，制得對照藥材溶液。按烏及丸制備工藝，制備烏及丸缺延胡索陰性樣品，取1丸，按供試品溶液制備方法操作，制得烏及丸缺延胡索陰性樣品溶液。照薄層色譜法[2]，取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，置層析缸中，展開劑為乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水(10∶1∶1.5∶2)，展開，取出，晾干，在紫外光燈(365 nm)下檢視，在烏及丸供試品色譜與延胡索對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾(圖4)。此外，3批樣品熒光斑點(diǎn)重現(xiàn)性較好(圖5)。

2.2.2 高良姜[3]取烏及丸2丸，剪碎，加硅藻土8 g研粉，加二氯甲烷50 ml超聲30 min，過濾，濾液蒸干，加二氯甲烷1 ml 使溶解，作為供試品溶液；另取高良姜對照藥材研粉末5 g，按供試品溶液制備方法操作，制得對照藥材溶液；按烏及丸制備工藝，制備烏及丸缺高良姜陰性樣品，取2丸，按供試品溶液制備方法操作，制得烏及丸缺高良姜陰性樣品溶液。照薄層色譜法[2]取上述3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，置層析缸中，展開劑為石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(9∶1∶0.1)，展開，取出，晾干，用5%香草醛硫酸溶液顯色，放于干燥箱內(nèi)105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。烏及丸供試品與高良姜對照藥材色譜相同位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無此斑點(diǎn)(圖6)。此外，3批樣品斑點(diǎn)重現(xiàn)性較好(圖7)。

圖4 延胡索薄層色譜鑒別(專屬性)

圖5 延胡索薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

圖6 高良姜薄層色譜鑒別(專屬性)

圖7 高良姜薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

2.2.3 甘草[1，4]取烏及丸1丸，剪碎，加4 g硅藻土研磨成粉末，加鹽酸10 ml及二氯甲烷50 ml加熱回流1 h，放至室溫，過濾，濾液蒸干，加二氯甲烷1 ml使溶解，作為供試品溶液；精密稱取甘草次酸對照品20 mg于10 ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，作為甘草次酸對照品溶液；按烏及丸制備工藝，制備烏及丸缺甘草陰性樣品，取1丸，按供試品溶液制備方法操作，制得烏及丸缺甘草陰性樣品溶液。參照薄層色譜法[2]，制得烏及丸缺甘草的陰性樣品溶液。參照薄層色譜法[2]，取上述3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于硅膠GF254薄層板上，置層析缸中，展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(3∶1∶0.2)，展開，取出，晾干，在紫外光燈(254 nm)下檢視，烏及丸供試品色譜與甘草次酸對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同深藍(lán)色的斑點(diǎn)，陰性對照無此斑點(diǎn)(圖8)。此外，3批樣品此斑點(diǎn)重現(xiàn)性較好(圖9)。

圖8 甘草薄層色譜鑒別 (專屬性)

2.3 烏及丸中芍藥苷含量測定[1，5-6]

2.3.1 溶液的制備 ①對照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷對照品(已置五氧化二磷減壓干燥器中12 h)20 mg于500 ml容量瓶中，加入適量稀乙醇使溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液。②烏及丸樣品溶液的制備：取烏及丸1.5 g，剪碎，精密稱定，加硅藻土適量，研磨成粉末，放于已精密加入50 ml稀乙醇的三角瓶中，密塞后稱重，超聲30 min，放至室溫，稱重并補(bǔ)充稀乙醇至超聲前重量，過濾，取續(xù)濾液，作為烏及丸樣品溶液。③陰性樣品溶液的制備：取除白芍外的其他藥材，按烏及丸處方比例及制劑工藝制成丸劑，按照“2.3.2”項(xiàng)方法制成陰性樣品溶液。

圖9 甘草薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

2.3.2 色譜條件與專屬性 VP-ODS (5 μm,4.6 mm×150 mm) 色譜柱；乙腈-0.1%磷酸(15∶85)為流動相；柱溫：30 ℃；流速：1 ml/min；在230 nm波長下檢測；各種溶液分別進(jìn)樣10 μl；理論板數(shù)按芍藥苷峰計算不低于2 000。分別取上述3種溶液進(jìn)樣，結(jié)果表明，樣品中待測成分分離良好，陰性對照無干擾，見圖10。

2.3.3 芍藥苷對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線 在100 ml容量瓶中精密稱取芍藥苷對照品(已置五氧化二磷減壓干燥器中12 h)25 mg，加入稀乙醇使溶解并稀釋至刻度，配制成250 μg/ml芍藥苷對照品溶液，分別精密取此芍藥苷對照品溶液0.5、1、2、4、8、16 ml于50 ml容量瓶中，加入稀乙醇使溶解并稀釋至刻度，配制成2.5、5、10、20、40、80 μg/ml的溶液，注入液相色譜儀各10 μl，按“2.3.2”項(xiàng)方法測定各自峰面積，以對照品濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計算得回歸方程Y=5 456.1X-4 956.7，r=0.999 4。結(jié)果可見測得峰面積與芍藥苷對照品在2.5～80 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度 精密吸取芍藥苷對照品溶液10 μl，按“2.3.2”項(xiàng)方法連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果峰面積值的RSD為0.45% (n=6)，符合要求。

2.3.5 穩(wěn)定性 取同一批烏及丸樣品約1.5 g，剪碎，精密稱定，加硅藻土適量，研磨成粉末，按照“2.3.1”項(xiàng)操作制備供試品溶液，取續(xù)濾液按“2.3.2”項(xiàng)分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，測得芍藥苷對照品峰面積值的RSD為1.81% (n=5)，表明其在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性 取同一批烏及丸約1.5 g(共6份)，精密稱定，加硅藻土適量，研磨成粉末，按照“2.3.1”項(xiàng)操作制備供試品溶液，取續(xù)濾液按“2.3.2”項(xiàng)方法測定。結(jié)果樣品中芍藥苷平均含量為0.77 mg/g，RSD為1.68% (n=6)，符合要求。

2.3.7 加樣回收率 分別精密稱定同一批共6份烏及丸(每份約0.7 g)，分別剪碎后，加入芍藥苷對照品溶液(560 μg/ml)各1 ml，稱定重量后加硅藻土適量，研磨成粉末，放于已精密加入50 ml稀乙醇的三角瓶中，密塞后稱重，超聲30 min，放至室溫，稱重并補(bǔ)足重量，取其續(xù)濾液，按“2.3.2”項(xiàng)方法測定樣品中芍藥苷含量，結(jié)果符合要求。見表1。

2.3.8 樣品測定 取3個不同批號(批號：20141120、20141204、20141218)的烏及丸樣品，按“2.3.1”項(xiàng)操作，按“2.3.2”測定其中芍藥苷的含量。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 《中國藥典》及文獻(xiàn)中延胡索的薄層色譜鑒別多采用較大比例的甲醇作為提取溶劑，因其對實(shí)驗(yàn)操作人員危害較大，故在本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)多次試驗(yàn)將其替換為毒性較小的二氯甲烷作為提取溶劑，達(dá)到同樣提取效果的同時降低了對實(shí)驗(yàn)操作人員健康的損害。

3.2 烏及丸中芍藥苷含量測定中，制備樣品溶液時，為了保證回收率，本實(shí)驗(yàn)分別對提取方式、提取溶劑、溶劑用量、提取時間及提取次數(shù)進(jìn)行考察。其中考察提取方式時，分別采用浸泡、超聲提取與加熱回流的方式，結(jié)果表明，采用超聲和加熱提取方法時，二者所測得的芍藥苷含量較高且含量相當(dāng)，故將提取方法定為操作更為簡便、重現(xiàn)性更好的超聲提??；考察提取溶劑時，分別使用了30%乙醇、稀乙醇、甲醇、30%甲醇等溶劑，結(jié)果表明，提取溶劑為稀乙醇及甲醇時所測得的芍藥苷含量近似且高于其他溶劑，故采用稀乙醇為提取溶劑，結(jié)果滿意。

圖10 芍藥苷高效液相色譜圖

編號烏及丸樣品量(g)烏及丸中芍藥苷量(mg)芍藥苷對照品加入量(mg)芍藥苷測得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)10.701 20.540.561.0999.0920.701 60.540.561.11100.930.701 50.540.561.11100.9100.80.8940.708 10.540.561.11100.950.710 90.550.561.12101.860.708 60.540.561.11100.9

表2 烏及丸含量測定結(jié)果

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