基于專(zhuān)利角度的纖維素降解生物法預(yù)處理研發(fā)進(jìn)展

鄭玉榮， 靳軍寶,2， 白光祖， 吳新年*， 劉秋艷,2

（1. 中國(guó)科學(xué)院蘭州文獻(xiàn)情報(bào)中心，甘肅 蘭州 730000；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

纖維素降解研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化是全球熱點(diǎn)方向之一，全球范圍內(nèi)天然纖維素原料非常豐富（包括農(nóng)作物秸稈、林業(yè)副產(chǎn)品、城市垃圾等），將纖維素進(jìn)行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物燃料、飼料、食品等生物質(zhì)產(chǎn)品對(duì)于解決環(huán)境污染、資源浪費(fèi)、食品短缺、能源危機(jī)等方面具有現(xiàn)實(shí)意義[1-2]。全球纖維素利用主要通過(guò)糖平臺(tái)（生物法）和熱化學(xué)平臺(tái)轉(zhuǎn)化[3-4]，糖平臺(tái)先將纖維素原料轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵型糖，再利用酵母發(fā)酵轉(zhuǎn)化為生物產(chǎn)品，熱化學(xué)平臺(tái)則先氣化纖維素原料再轉(zhuǎn)化為生物產(chǎn)品。

圖1 天然纖維素利用流程

纖維素的生物轉(zhuǎn)化利用分為原料預(yù)處理、酶水解、糖發(fā)酵3個(gè)階段（如圖1所示），目前主要的技術(shù)瓶頸在于預(yù)處理技術(shù)不夠成熟、纖維素酶活性較低及轉(zhuǎn)化效率不高等，造成生產(chǎn)成本過(guò)高[5]。預(yù)處理階段應(yīng)用較多的是物理化學(xué)法（包括蒸汽爆破、氨纖維爆破等）、化學(xué)法（酸處理、堿處理、離子液體處理等）、物理法等[6]，在效率相對(duì)較高的同時(shí)帶來(lái)新的環(huán)境污染與能源消耗問(wèn)題，后續(xù)處理也存在其他方面的問(wèn)題（如抑制問(wèn)題）。生物法克服了其他方法的缺點(diǎn)，但存在效率有待提高和成本過(guò)高的問(wèn)題（時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本），但是從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，通過(guò)生物技術(shù)和生物工程解決效率和成本問(wèn)題[7-8]，生物法將得到快速發(fā)展[9-10]。

全球圍繞生物法的效率問(wèn)題和成本問(wèn)題進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究，經(jīng)由相關(guān)研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)合作，建設(shè)纖維素產(chǎn)業(yè)化利用示范裝置，推進(jìn)纖維素的生物轉(zhuǎn)化進(jìn)程。我國(guó)《可再生能源發(fā)展十三五規(guī)劃》新增投資2.5萬(wàn)億元發(fā)展包括生物質(zhì)利用在內(nèi)的可再生能源，美國(guó)和歐盟也以立法形式規(guī)定了將來(lái)某時(shí)間段纖維素燃料在整個(gè)燃料體系中的比例，并且以政策形式進(jìn)行支持。

本文收集了國(guó)內(nèi)外纖維素降解生物法預(yù)處理方面的發(fā)明專(zhuān)利（數(shù)據(jù)來(lái)源：Derwent Innovations Index），應(yīng)用Thomson Data Analyzer、INNOGRAPHY等主流情報(bào)分析軟件，對(duì)全球范圍內(nèi)纖維素降解生物法預(yù)處理總體研發(fā)情況、技術(shù)研發(fā)脈絡(luò)、重點(diǎn)技術(shù)方向及核心技術(shù)發(fā)展態(tài)勢(shì)進(jìn)行了分析。

1 專(zhuān)利總體研發(fā)進(jìn)展

1.1 總體研發(fā)態(tài)勢(shì)

截止2017年底（檢索日為2017年12月31日），全球纖維素降解生物法預(yù)處理專(zhuān)利數(shù)為572條，占到整個(gè)預(yù)處理技術(shù)的6.93%（總預(yù)處理專(zhuān)利技術(shù)8256條），總體上不占優(yōu)勢(shì)，處于發(fā)展期（圖1），其中2015年達(dá)到74條，為歷年最高（注：因?qū)＠麛?shù)據(jù)滯后，2016、2017年的專(zhuān)利數(shù)據(jù)不全）。

圖2 纖維素降解生物法預(yù)處理專(zhuān)利技術(shù)年際變化

圖3 纖維素降解生物法預(yù)處理專(zhuān)利技術(shù)主要研發(fā)國(guó)家

如圖2所示，美國(guó)是纖維素降解生物法預(yù)處理專(zhuān)利主要的研發(fā)國(guó)，另外中國(guó)、歐洲、日本也是重要的研發(fā)地區(qū)。如表 1，諾維信是纖維素降解生物法預(yù)處理專(zhuān)利技術(shù)最主要的專(zhuān)利權(quán)人（109條，占整個(gè)生物法預(yù)處理技術(shù)的19.06%，下同），其他還包括荷蘭帝斯曼（38條，占6.64%）、加拿大IOGEN（29條，占5.07%）、杜邦丹尼斯克、法國(guó)石油與新能源研究院等（如表1所示）。

表1 纖維素降解生物法預(yù)處理主要研發(fā)機(jī)構(gòu)

（續(xù)表1）

1.2 主要研發(fā)方向

纖維素降解生物法預(yù)處理專(zhuān)利技術(shù)主要涉及發(fā)酵技術(shù)與工藝（包括產(chǎn)品，占78.40%）、酶工程技術(shù)（占43.39%）、菌種選育技術(shù)（占38.91%）三個(gè)技術(shù)方向，其中能產(chǎn)生高效降解酶的菌種選育技術(shù)是生物法預(yù)處理的關(guān)鍵。

如表2，經(jīng)分析相關(guān)專(zhuān)利技術(shù)研發(fā)脈絡(luò)，上世紀(jì)80年代開(kāi)始，纖維素降解生物法預(yù)處理專(zhuān)利技術(shù)經(jīng)歷了酶的分離與培養(yǎng)、微觀層面研發(fā)（包括纖維素細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、DNA序列等）、破除木質(zhì)素結(jié)合鍵、減少酶用量及提高發(fā)酵率、同步糖化發(fā)酵、產(chǎn)業(yè)化的經(jīng)濟(jì)性及可行性、基因改造與表達(dá)、多階段聯(lián)合處理、耐高溫多功能降解菌種等（如表2所示）。

表2 纖維素降解生物法預(yù)處理技術(shù)演進(jìn)

誘變選育技術(shù)的主要研發(fā)機(jī)構(gòu)包括諾維信、加拿大IOGEN、杜邦丹尼斯克等，技術(shù)重點(diǎn)是選育的菌株分泌高效組合酶對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行降解，組合酶的重要特征一是表現(xiàn)出顯著協(xié)同作用，二可以全流程作用起作用，減少后期糖化和發(fā)酵階段的外源酶加入量。具體技術(shù)點(diǎn)包括極端環(huán)境菌種（寬pH范圍、高熱、低溫等）篩選技術(shù)、菌株高通量篩選技術(shù)（包括微流控真菌高通量篩選技術(shù)、流式細(xì)胞儀細(xì)菌高通量篩選技術(shù)等）、五碳糖六碳糖共利用菌株選育技術(shù)、高效物理化學(xué)組合誘變技術(shù)、高效菌定向選育技術(shù)、應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵菌種選育技術(shù)、高效物理（紫外、重離子、等離子輻射等）誘變技術(shù)、高耐熱工程菌模擬預(yù)測(cè)技術(shù)、流程化選育平臺(tái)、多菌協(xié)同培育技術(shù)等。

基因工程選育技術(shù)是通過(guò)遺傳工程對(duì)降解木質(zhì)素（半纖維素）起作用的基因片段進(jìn)行基因改造，從而提高降解效率。研發(fā)主要集中在兩個(gè)方向上，一是對(duì)新基因（核酸序列）的篩選、鑒定、分離，二是通過(guò)遺傳工程改造基因并進(jìn)行菌株表達(dá)。具體的技術(shù)點(diǎn)包括蛋白組學(xué)技術(shù)、多基因融合技術(shù)、菌種突變技術(shù)、定向進(jìn)化集成技術(shù)、基因定向突變技術(shù)、高效降解菌基因（組）鑒定技術(shù)、同源重組增強(qiáng)技術(shù)、不需預(yù)處理生物降解菌改造技術(shù)、活性位點(diǎn)識(shí)別技術(shù)、高效纖維素菌株基因組（群）融合技術(shù)等。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)針對(duì)纖維素降解生物法預(yù)處理在酶種選培育、基因工程改造、成本控制等方面開(kāi)展了大量的研究，中國(guó)石化通過(guò)選育木霉屬菌株去除預(yù)處理階段引入的多種抑制物[11]、華中科技大學(xué)張曉昱團(tuán)隊(duì)通過(guò)擔(dān)子菌對(duì)木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理、降解與轉(zhuǎn)化[12]，山東尤特爾采用中性纖維素酶預(yù)處理木質(zhì)纖維素以降低成本[13]，另外青島蔚藍(lán)、南京百斯杰、寧夏夏盛、華東師范大學(xué)等也有針對(duì)性的開(kāi)展了相關(guān)研發(fā)活動(dòng)。

1.3 后續(xù)研發(fā)重點(diǎn)

引用專(zhuān)利數(shù)據(jù)集的文獻(xiàn)，稱(chēng)為該專(zhuān)利數(shù)據(jù)集的后引文獻(xiàn)，通過(guò)后引文獻(xiàn)可以分析該數(shù)據(jù)集專(zhuān)利技術(shù)對(duì)后續(xù)專(zhuān)利技術(shù)研發(fā)、應(yīng)用等方面的作用與影響，尤其核心專(zhuān)利技術(shù)對(duì)后續(xù)研發(fā)的影響具有重要作用，很多后續(xù)研發(fā)的專(zhuān)利技術(shù)會(huì)圍繞核心專(zhuān)利進(jìn)行專(zhuān)利布局，其結(jié)果會(huì)影響產(chǎn)業(yè)布局和經(jīng)濟(jì)利益。

分析相關(guān)后續(xù)研發(fā)機(jī)構(gòu)分布，除了諾維信、杜邦丹尼斯克、荷蘭帝斯曼、加拿大IOGEN、私有酶技術(shù)公司等研發(fā)主力外，英國(guó)石油公司、殼牌石油公司、美國(guó)可再生能源國(guó)家實(shí)驗(yàn)室、阿本戈生物能源等一些石油和能源公司也對(duì)相關(guān)技術(shù)進(jìn)行大量引用。

分析后引專(zhuān)利的技術(shù)方向可以發(fā)現(xiàn)，后引主要以應(yīng)用為主，涉及到制備目標(biāo)產(chǎn)品、所使用的酶、所使用的材料、發(fā)酵的工藝等，其中在堆制有機(jī)肥料、肥料與土壤調(diào)理劑的混合物、有機(jī)廢料回收或加工、動(dòng)物飼料、添加酶或微生物進(jìn)行谷物材料發(fā)酵等技術(shù)是以后熱點(diǎn)的研發(fā)方向，一定程度上說(shuō)明降解研發(fā)方向和降解產(chǎn)品趨向多元化。

1.4 研發(fā)基礎(chǔ)分析

科學(xué)技術(shù)能持續(xù)不斷的向前推進(jìn)，是因?yàn)榻⒃谥暗幕A(chǔ)研究之上。專(zhuān)利數(shù)據(jù)集所參考的文獻(xiàn)，稱(chēng)為該專(zhuān)利數(shù)據(jù)集的前引文獻(xiàn)，是專(zhuān)利技術(shù)繼續(xù)研發(fā)的基礎(chǔ)。研究前引文獻(xiàn)可以分析該數(shù)據(jù)集專(zhuān)利技術(shù)所賴以產(chǎn)生的基礎(chǔ)科學(xué)研究發(fā)展態(tài)勢(shì)，通過(guò)研究主題的重點(diǎn)、發(fā)展與變化、對(duì)核心技術(shù)發(fā)展脈絡(luò)等進(jìn)行分析，可以遴選出具有發(fā)展前景的核心技術(shù)方向及其演化路徑。

如表3所示，纖維素生物法預(yù)處理技術(shù)所參考的科學(xué)文獻(xiàn)大約有4 400多篇（主要為期刊論文、會(huì)議、報(bào)告、圖書(shū)等，不包括專(zhuān)利引用），通過(guò)被引次數(shù)指數(shù)曲線和加權(quán)指數(shù)曲線共篩選出核心參考論文293篇，大約占到整個(gè)參考論文總數(shù)的 6.6%左右。核心參考論文產(chǎn)出國(guó)以美國(guó)為主，占了總參考論文的 36%，另外丹麥、瑞典、日本、加拿大、芬蘭也有一定量的核心論文產(chǎn)出。核心參考文獻(xiàn)的研究方向主要集中在嗜熱細(xì)菌、高固態(tài)原料直接發(fā)酵、銅離子依賴糖苷酶GH61家族、相關(guān)的原理與降解模型等。

表3 部分被專(zhuān)利參考的代表性核心論文

（續(xù)表3）

2 核心專(zhuān)利技術(shù)

在專(zhuān)利數(shù)據(jù)中，針對(duì)具體的技術(shù)領(lǐng)域會(huì)形成一個(gè)專(zhuān)利群，專(zhuān)利群中每件專(zhuān)利根據(jù)其價(jià)值和作用分為核心專(zhuān)利、重要專(zhuān)利和一般專(zhuān)利，其中核心專(zhuān)利處于專(zhuān)利群的核心位置和節(jié)點(diǎn)地位，對(duì)整個(gè)專(zhuān)利研發(fā)的走向起重要作用，并最終影響產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[14]。

本文通過(guò)INNOGRAPHY的專(zhuān)利強(qiáng)度特征指標(biāo)和被引用指標(biāo)選擇出纖維素生物法預(yù)處理技術(shù)的核心專(zhuān)利數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，核心專(zhuān)利主要集中在美國(guó)、歐洲專(zhuān)利局、世界專(zhuān)利組織等，其中美國(guó)無(wú)論在核心專(zhuān)利優(yōu)先權(quán)，還是同族專(zhuān)利數(shù)量方面都高于其他國(guó)家和地區(qū)。主要研發(fā)企業(yè)包括諾維信、加拿大IOGEN、荷蘭帝斯曼、DYADIC國(guó)際等，上述四家企業(yè)的核心專(zhuān)利占全部核心專(zhuān)利量的80%。

纖維素生物降解核心專(zhuān)利涉及到高效菌株選育技術(shù)、組合酶及其構(gòu)建方法、酶性能增強(qiáng)、遺傳工程及其載體表達(dá)、聯(lián)合協(xié)同處理技術(shù)等方面。組合酶及其構(gòu)建方面，DYADIC國(guó)際通過(guò)酶促水解纖維素構(gòu)建高效纖維素酶組合物[15]，能高效地將生物質(zhì)木質(zhì)纖維素（涉及到常見(jiàn)的各種木質(zhì)纖維素材料，包括自然界植物、農(nóng)作物木質(zhì)纖維素、工業(yè)廢棄物等）轉(zhuǎn)化為葡萄糖。諾維信[16]研發(fā)的酶組合物包括煙曲霉纖維二糖水解酶Ⅰ、煙曲霉纖維 二糖水解酶Ⅱ、煙曲霉 β-葡糖苷酶或其變體、具有纖維素分解增強(qiáng)活性的青霉屬種GH61多肽等。

高效菌株選育技術(shù)方面，MASCOMA[17]培育菌株既可以產(chǎn)生水解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素與碳水化合物之間連接的酶，也可以直接通過(guò)高固態(tài)直接生產(chǎn)乙醇等產(chǎn)品，并且減少在同時(shí)糖化和發(fā)酵（SSF）過(guò)程中水解生物質(zhì)原料所需加入的外源酶量。DSM I P[18]的Talaromyces突變菌株能高效分解木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)生物產(chǎn)品，分泌 CBHⅠ、CBHⅡ、EG/CEA、EG/CEB、木聚糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、膨脹因子樣蛋白、EG/GH61等酶。

遺傳工程及其載體表達(dá)方面，Novozymes Inc[19]通過(guò)研發(fā)具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸，如棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶活性多肽[20]，構(gòu)建載體和宿主細(xì)胞。

酶性能增強(qiáng)方面，諾維信研發(fā)了增強(qiáng)纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化的方法，在具有纖維素分解增強(qiáng)活性多肽的存在下用酶組合物處理纖維素材料，組合酶包括半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、膨脹素等[21]；也研發(fā)了通過(guò)非催化性碳水化合物結(jié)合組件（CBM）增強(qiáng)糖基水解酶家族61（GH61）的相關(guān)技術(shù)[20]；另外諾維信研發(fā)了通過(guò)酶活性增強(qiáng)酶組合物在高溫條件（54℃～70℃）下分解纖維素材料[22]。

3 結(jié)語(yǔ)

纖維素降解生物法預(yù)處理總體上還處于發(fā)展期，研發(fā)力度有限，與其他物理化學(xué)法、化學(xué)法等預(yù)處理方法相比生產(chǎn)成本還處于較高水平，酶解效率也有待提高。目前全球研發(fā)重點(diǎn)有兩個(gè)，一是選育分泌高效降解組合酶的菌株，二是通過(guò)遺傳工程對(duì)降解木質(zhì)纖維素起作用的基因片段進(jìn)行基因改造，從而提高降解效率。

美國(guó)纖維素降解生物法預(yù)處理專(zhuān)利技術(shù)研發(fā)特征是以企業(yè)為主，研究型機(jī)構(gòu)在基礎(chǔ)研究上進(jìn)行配合的局面，有相應(yīng)的政策規(guī)劃和產(chǎn)業(yè)化示范。中國(guó)纖維素降解生物法預(yù)處理研發(fā)以研究型機(jī)構(gòu)為主，產(chǎn)業(yè)化示范有限，研發(fā)基礎(chǔ)也相對(duì)薄弱。

纖維素生物降解產(chǎn)業(yè)化涉及諸多因素，除了技術(shù)層面的問(wèn)題，還與諸如因素包括原料（如穩(wěn)定的原料價(jià)格）、物流交通狀況、生物產(chǎn)品高價(jià)值化、生物產(chǎn)品多樣化、以及其他相關(guān)配套產(chǎn)業(yè)的發(fā)展等有較大關(guān)聯(lián)，發(fā)展纖維素生物降解產(chǎn)業(yè)任重而道遠(yuǎn)。

[1]王國(guó)珍. 纖維素轉(zhuǎn)化為有機(jī)化合物的降解研究[D]. 武漢大學(xué), 2016.

[2] Beguin P, Aubert J P. The biological degradation of cellulose[J]. Fems Microbiology Reviews, 1994, 13(1): 25-58.

[3] Zhang C Q, Qi W, Wang F, et al. Ethanol from corn stover using SSF: An economic assessment[J]. Energy Sources Part B-Economics Planning and Policy, 2011, 6(2): 136-144.

[4]張建. 木質(zhì)纖維素原料生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)纖維素乙醇過(guò)程的關(guān)鍵技術(shù)研究[D]. 華東理工大學(xué), 2011.

[5] Sindhu R, Binod P, Pandey A. Biological pretreatment of lignocellulosic biomass - An overview[J]. Bioresource Technology, 2016, 199: 76-82.

[6] Carrere H, AntonopoulouG, Affes R, et al. Review of feedstock pretreatment strategies for improved anaerobic digestion: From lab-scale research to full-scale application[J]. Bioresource Technology, 2016, 199: 386-397.

[7] Guerriero G, Hausman J F, Strauss J, et al. Lignocellulosic biomass: Biosynthesis, degradation, and industrial utilization[J].Engineering in Life Sciences, 2016, 16(1): 1-16.

[8] Klyosov A A. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation[J]. Biochemistry, 1990, 29(47): 10577-10585.

[9] Quinlan R J, Sweeney M D, LoLeggio L, et al. Insights into the oxidative degradation of cellulose by a copper metalloenzyme that exploits biomass components[J]. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States Of America,2011,108(37): 15079-15084.

[10] Van Dyk J S, Pletschke B I. A review of lignocellulose bioconversion using enzymatic hydrolysis and synergistic cooperation between enzymes-factors affecting enzymes, conversion and synergy[J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(6): 1458-1480.

[11]中國(guó)石油化工股份有限公司. 一株綠色木霉及其應(yīng)用: CN,105647813A[P]. 北京: 2016-06-08.

[12]華中科技大學(xué). 一種獲取可轉(zhuǎn)化底物的木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理方法: CN, 101392268[P]. 湖北: 2009-03-25.

[13]湖南尤特爾生化有限公司. 高活性纖維素酶組合物及其制備方法: CN, 1335395[P]. 湖南: 2002-02-13.

[14]鄭玉榮, 吳新年, 田曉陽(yáng), 等. 基于產(chǎn)業(yè)尺度的核心專(zhuān)利判別方法研究——以鎳基高溫合金專(zhuān)利為例[J]. 情報(bào)理論與實(shí)踐, 2014, 37(7): 81-85.

[15] Dyadic Int Inc. New enzyme formulation, useful in producing fermentable sugars from lignocellulosic material, a fermentation product or a starting material for a fermentation product from a fermentable sugar or energy from a fermentable sugar: US,2007238155-A1[P]. 1996-10-10(Derwent Primary Accession Number: 2008A45847).

[16] Novozymes Inc. Enzyme composition, useful for e.g. degrading cellulosic material, comprises Aspergillus fumigatus cellobiohydrolase I and II, Aspergillus fumigatus beta glucosidase, and Penicillium species glycoside hydrolase 61 polypeptide:WO, 2013028928-A1[P]. 2011-8-24(Derwent PrimaryAccession Number: 2013C73200).

[17] Mascoma Corp. New recombinant yeast host cell containing heterologous polynucleotides encoding a polypeptide comprising specific amino acid sequences for fermenting lignocellulosic biomass e.g. corn fiber, and for converting acetate to ethanol: WO,2011153516-A2[P]. 2010-6-3(Derwent Primary Accession Number: 2011P96645).

[18] Dsm I P, Assets B V. Conditioning method for unrecycled ambient air - exhausting combined air stream from defined space so as combined air stream is not recirculated to conditioning module: US, 5408838-A[P]. 1993-10-21(Derwent Primary Accession Number: 1995169122).

[19] Novozymes Inc. New isolated polypeptide having acetylxylan esterase activity, useful for degrading or modifying plant cell walls or any xylan-containing material originating from plant cells walls: WO, 2009073709-A1[P]. 2007-12-6(Derwent Primary Accession Number: 2009K28488).

[20] Novozymes Inc. New carbohydrate-binding module, useful in detergent composition or textile finishing processes, and for purifying polypeptides, baking, modifying plant cell walls, biofuel production, or processing of cellulose fiber: WO,2005042735-A1[P]. 2003-10-30(Derwent Primary Accession Number: 2005346874).

[21] Novozymes Inc. Degrading or converting cellulosic material into sugar e.g. glucose, and fermentation product e.g. ethanol,comprises treating cellulosic material with an enzyme composition in presence of polypeptide having cellulolytic enhancing activity: WO, 2010138754-A1[P]. 2009-5-29(Derwent Primary Accession Number: 2010P75648).

[22] Novozymes Inc. Degrading or converting cellulosic material, comprises treating the cellulosic material under high temperature conditions with enzyme composition in the presence of glycoside hydrolase 61 polypeptide having cellulolytic enhancing activity: WO, 2012149344-A1[P]. 2011-4-29(Derwent Primary Accession Number: 2012P05661).