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    纖維素降解菌的篩選、酶活及對(duì)稻草秸稈的降解研究1

    2018-07-05 01:57:10何麗芳陳曉華李玉中
    纖維素科學(xué)與技術(shù) 2018年2期
    關(guān)鍵詞:青霉稻草纖維素

    劉 最, 何麗芳, 陳曉華, 滕 濤, 李玉中*

    (衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院,湖南 衡陽(yáng) 421008)

    我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó),年產(chǎn)農(nóng)作物秸稈約5.7億噸以上,占世界秸稈總產(chǎn)量的20%~30%[1]。因此,秸稈是我國(guó)極為豐富的可再生資源。在水稻產(chǎn)區(qū),稻草秸稈占農(nóng)作物秸稈的絕大部分。秸稈還田技術(shù)是當(dāng)今世界范疇內(nèi)改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境、發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、促進(jìn)綠色食品產(chǎn)業(yè)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要措施[2]。但秸稈在自然狀態(tài)下降解緩慢,阻礙了這一措施的推廣和實(shí)施。目前絕大部分稻草秸稈仍然被焚燒,不僅對(duì)環(huán)境造成了一定的污染[3],同時(shí)也存在一定的安全隱患。另外,由于秸稈的焚燒導(dǎo)致土壤營(yíng)養(yǎng)成分的丟失,使用額外的化學(xué)肥料或農(nóng)家肥料來補(bǔ)充,從而造成更為嚴(yán)重的二次大氣污染[4]。

    因此,如何快速降解秸稈成為解決秸稈還田的關(guān)鍵。秸稈降解緩慢的主要原因是其內(nèi)含有大量的纖維素,纖維素的降解速度決定了秸稈還田的速度[5]。目前,關(guān)于纖維素降解的方法常見的有化學(xué)降解法、物理降解法和生物降解法。而生物降解法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),如安全環(huán)保、降解速率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。因而,纖維素降解菌的分離、篩選和酶活性的測(cè)定成為當(dāng)前研究的一大熱點(diǎn)[6-10]。

    為了加速秸稈還田,促進(jìn)農(nóng)業(yè)生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展,有必要篩選稻田纖維素降解微生物,以期用于稻田秸稈的還田。同時(shí),解決當(dāng)前慣用的焚燒法處理稻草秸稈所造成的環(huán)境污染問題。目前,國(guó)內(nèi)外分離篩選出的纖維素降解真菌主要集中在木霉屬、青霉屬、曲霉屬、根霉屬、漆斑霉屬等絲狀真菌[11],但關(guān)于冬克青霉降解纖維素的研究還未見報(bào)道。并且關(guān)于該菌株的相關(guān)研究報(bào)道少,《中國(guó)真菌志》記載冬克青霉為罕見菌種,不易分離,在我國(guó)上海和湖北神農(nóng)架鮮有分布[12]。

    本文從富含纖維素的土壤中采集土壤樣本,分離和篩選纖維素降解菌株,為高效處理農(nóng)作物秸稈等纖維素資源及秸稈快速還田提供新資源。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 材料

    1.1.1 樣本

    在衡陽(yáng)市郊區(qū)及祁東縣采集稻田土壤樣本,并編號(hào),實(shí)驗(yàn)樣本編號(hào)及采集地點(diǎn)如表1所示。

    表1 樣本采集信息

    1.1.2 培養(yǎng)基

    富集培養(yǎng)基(濾紙條液體培養(yǎng)基):(NH4)2SO43.0 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g,KH2PO41.0 g,MnSO4·H2O 0.001 6 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,ZnSO4·7H2O 0.001 7 g,CaCl20.1 g,CoCl20.002 g,NaCl 0.1 g,蒸餾水 1 000 mL,pH值6.5。

    篩選培養(yǎng)基(剛果紅纖維素瓊脂)[11]:KH2PO40.5 g,MgSO40.25 g,瓊脂14 g,明膠2 g,纖維素粉1.88 g,剛果紅0.2 g,蒸餾水1 000 mL,pH7.0。

    PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,瓊脂粉20 g,水1 000 mL,自然pH。

    種子培養(yǎng)基:CMC-Na 10.0 g,蛋白胨10.0 g,酵母膏10.0 g,KH2PO42.0 g,(NH4)2SO41.5 g,蒸餾水1 000 mL。

    液體發(fā)酵培養(yǎng)基:CMC-Na 5 g,蛋白胨3 g,牛肉膏1 g,蒸餾水1 000 mL,自然pH。查氏酵母膏瓊脂(CYA)[12]:

    1)查氏濃儲(chǔ)液備用:NaNO330 g,KCl 5 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,水 100 mL。

    2)CYA配方:K2HPO41.0 g,查氏濃儲(chǔ)液10 mL,酵母膏5 g,蔗糖30 g,瓊脂15 g,水1 000 mL。

    稻草固體培養(yǎng)基:將稻草秸稈剪成約1 cm的小片段,用自來水洗滌后進(jìn)行40目的過篩處理,隨后將其置于鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重,進(jìn)行壓制處理后均等分裝于潔凈的廣口培養(yǎng)瓶中(每瓶3 g),再分別加入12 mL的水。蓋上蓋子濕熱滅菌。

    1.2 方法

    1.2.1 菌株富集培養(yǎng)及分離

    稱取采集的各樣本5 g,加至裝有無菌玻璃珠的三角錐形瓶中,加入50 mL無菌水充分混合均勻,搖床充分振蕩20 min,用滅菌紗布過濾,靜置1 h,取上清液 1 mL接種于富集培養(yǎng)基中,220 r/min、28℃培養(yǎng) 5~7 d,使纖維素降解菌富集,并觀察記錄濾紙條的降解情況。取濾紙條降解的樣品懸浮液各 0.1 mL,分別涂布接種到加有0.01%青霉素和0.01%農(nóng)用硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基平板上,25~26℃培養(yǎng)72 h,觀察菌落生長(zhǎng)情況,并進(jìn)行純化保藏。

    1.2.2 纖維素降解菌株的篩選

    將分離純化的菌株轉(zhuǎn)接至剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基中,每皿3點(diǎn),30℃培養(yǎng)4 d。若該菌產(chǎn)生纖維素酶,菌落周圍則會(huì)出現(xiàn)透明圈,用十字交叉法測(cè)量各菌落直徑(d, mm)和透明圈直徑(D, mm),依據(jù)D/d值大小來選擇產(chǎn)酶菌株,選取比值大的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

    1.2.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

    采用三點(diǎn)接種法和插片法將菌株1-4接種到鑒定培養(yǎng)基(CYA)上,于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,觀察菌落的形態(tài),顯微鏡下觀察菌絲大小、孢子梗及孢子等形態(tài),參閱《中國(guó)真菌志》[12]描述進(jìn)行形態(tài)鑒定。

    1.2.4 菌株1-4 FPAase的測(cè)定

    粗酶液制備:將菌株1-4接種到種子培養(yǎng)基中,30℃,180 r/min培養(yǎng)3 d,取2 mL接種于裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中。30℃,180 r/min培養(yǎng)4 d,吸取8 mL發(fā)酵液,4℃條件下4 000 r/min離心10 min,所得上清液即為粗酶液。

    濾紙?zhí)幚恚菏褂们皩⑵溆?%的醋酸溶液浸泡24 h以除去淀粉,用碘液檢驗(yàn),再用2%的NaHCO3溶液洗至中性,曬干。

    酶活測(cè)定:根據(jù)DNS(3,5-二硝基水楊酸)比色法測(cè)定總纖維素酶活力即濾紙酶活(FPAase)[13-14]。將50 mg經(jīng)預(yù)處理的定性濾紙放入25 mL比色管中,加入1 mL粗酶液,加1 mL CMC-Na的檸檬酸緩沖液(pH值5),以不加粗酶液反應(yīng)作為空白對(duì)照,50℃恒溫水浴中反應(yīng)60 min,加入1.5 mL DNS溶液,沸水浴10 min,迅速冷卻停止反應(yīng),定容至10 mL,于540 nm波長(zhǎng)測(cè)定其OD值。在上述測(cè)定條件下,每分鐘1 mL酶液催化底物水解生成1 μg葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位,用U/mL表示[15]。

    1.2.5 菌株1-4對(duì)稻草的降解效果

    用無菌生理鹽水洗脫下PDA上培養(yǎng)7 d的青霉1-4的孢子,將孢子配制成5×106個(gè)/mL濃度的懸浮液。取3 mL青霉1-4孢子懸浮液加入到滅菌稻草固體培養(yǎng)基。以加3 mL無菌水為對(duì)照。接種后28℃恒溫培養(yǎng),在培養(yǎng)7 d、14 d和21 d時(shí),分別取3瓶觀察稻草降解情況并按照薛惠琴等人[16]的方法測(cè)定稻草中纖維素的含量。在21 d時(shí),取少許稻草秸稈用乳酸酚棉蘭染液對(duì)其進(jìn)行染色處理,在顯微鏡下觀察稻草秸稈中菌株的生長(zhǎng)及分布情況,并拍照記錄。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 纖維素降解菌株的分離與初篩

    富集培養(yǎng)6 d后,6組樣本中的4組濾紙條有明顯的崩解現(xiàn)象,從這4組中用涂布平板法共分離得到16株具有纖維素降解活性的真菌菌株。(詳見表2)。

    表2 各類土樣中降解菌株的分離情況

    2.2 纖維素降解菌株的復(fù)篩

    剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基點(diǎn)接的16株純化真菌,從第 3 d 起菌落周圍開始出現(xiàn)透明圈,編號(hào)為1-4、6-2、6-3的 3 株菌透明圈較為明顯。其中,菌株1-4的菌落較小,生長(zhǎng)規(guī)整、圓形,透明圈最為明顯和清晰,其透明圈和菌落直徑比值最大,為1.22(表3)。菌株6-2、6-3菌落生長(zhǎng)不規(guī)則,其菌落周圍有一定的透明帶,但帶很窄(圖1)。從以上結(jié)果看,菌株1-4為分離到的降解纖維素能力最強(qiáng)的菌。

    表3 篩選所得菌株透明圈與菌落直徑

    圖1 3株復(fù)篩菌株在纖維素剛果紅培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈

    2.3 菌株1-4的形態(tài)鑒定結(jié)果

    菌株1-4在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d后菌落形態(tài)呈圓形絮狀,中心臍狀突起邊緣整齊,初期為灰綠色,粉末狀(圖 2a)。在查氏酵母膏固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí),菌落呈放射狀或有臍狀突起;質(zhì)地絨狀,初期呈白色,后期顏色轉(zhuǎn)暗(圖2b)。

    圖2 菌株1-4的形態(tài)學(xué)特征

    菌株?duì)I養(yǎng)菌絲體無色、有橫隔,分生孢子梗亦有橫隔。其生于基質(zhì)或氣生菌絲,孢子梗(40~70)-(200~250)×(2.0~3.0) μm,壁平滑,帚裝分枝頂端具有膨大的頂囊,達(dá)4.5 μm;帚狀枝單輪生,偶有梗基狀分枝;瓶梗每輪5~12個(gè),8.0~10.5×2.2~3.0 μm(圖2c);在400倍顯微鏡下觀察到該菌株的分生孢子近球形或球形,直徑2~2.5 μm,壁光滑;分生孢子鏈呈現(xiàn)較疏松的圓柱狀(圖2d)。經(jīng)形態(tài)鑒定,該菌株為類曲霉亞屬的冬克青霉(Penicillium donkii)。目前關(guān)于該菌株的相關(guān)研究報(bào)道少,《中國(guó)真菌志》記載冬克青霉為罕見菌種,不易分離,在我國(guó)上海和湖北神農(nóng)架鮮有分布[12]。

    2.4 菌株1-4 的FPAase

    液體發(fā)酵培養(yǎng) 5 d后菌株 1-4的 FPAase為 11.2 U/mL,之后酶活力隨著發(fā)酵天數(shù)延長(zhǎng)而增大,在第8 d天,酶活最大為15.0 U/mL,之后又開始減?。ㄈ鐖D3所示)??勺鳛橐恢昃哂袧摿Φ睦w維素降解菌。但要用于工業(yè)生產(chǎn)須對(duì)該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化,理化性質(zhì)進(jìn)行深入研究,以獲得更高的纖維素降解能力,以進(jìn)一步提高其利用價(jià)值,對(duì)實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

    圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株1-4總纖維素酶活性的影響

    2.5 菌株降解稻草效果

    經(jīng)觀察,培養(yǎng)7 d后,有少量的菌苔多生長(zhǎng)于稻草秸稈兩端的切口處,中間部位幾乎未見菌株生長(zhǎng)。培養(yǎng)到14 d時(shí),菌株的生長(zhǎng)情況明顯較第一周茂盛,而且菌落的顏色明顯有所加深。除了秸稈切口處生長(zhǎng)有濃密的菌落外,其中間部位也可見少量菌落生長(zhǎng)。培養(yǎng)到21 d時(shí),秸稈中間部位也生有較多的菌落。加入無菌水的對(duì)照組的稻草培養(yǎng)基中無明顯的變化。(圖4a~4d)。

    經(jīng)染色后在 10×40倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),菌株大多生長(zhǎng)于稻草秸稈端部的切口處,中間部位則分布有繁密的且雜亂的纖細(xì)菌絲體。菌株的染色較淺,分生孢子梗頸較短小,孢子梗上殘留的孢子穗數(shù)量也較少。(圖 4e、4f)

    圖4 菌株1-4在稻草秸稈上的生長(zhǎng)情況

    連續(xù)培養(yǎng)21 d后,對(duì)照中的纖維素含量由30.3%變?yōu)?9.91%,而接種菌株1-4的處理中稻草纖維素含量由接種前的30.3%減少至26.36%(如圖5所示)。說明菌株1-4對(duì)稻草秸稈中的纖維素具有一定的降解能力。研究發(fā)現(xiàn),菌落多出現(xiàn)在稻草秸稈的切口處。依據(jù)此特點(diǎn),在秸稈還田中,可將稻草秸稈處理的更碎以產(chǎn)生更多的切口,以利于菌株更好地生長(zhǎng),加快秸稈的降解。同時(shí)也可人為的培養(yǎng)該菌,將其和秸稈混施入土壤,提高菌量加快秸稈的降解速度。

    3 結(jié)論

    圖5 稻草培養(yǎng)基中纖維素含量與發(fā)酵時(shí)間關(guān)系圖

    本研究以篩選纖維素降解菌,加速秸稈還田為目的,從富含纖維素的樣本中分離出16 株真菌,通過纖維素剛果紅平板法復(fù)篩獲得3株可產(chǎn)生較明顯透明圈的真菌菌株(編號(hào)為1-4、6-2、6-3)。依據(jù)D/d值大小來選擇最終確定菌株1-4為最具纖維素降解能力的菌株,觀察菌株1-4在PDA和CYA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征和菌體顯微結(jié)構(gòu),經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為冬克青霉(Penicillium donkii),該菌為類曲霉亞屬真菌。該菌在28℃,180 r/min生長(zhǎng)第8 d時(shí)出現(xiàn)最高值,其總纖維素酶活為15.0 U/mL,該菌對(duì)稻草秸稈中纖維素的降解有一定的促進(jìn)作用。

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