黃瓜白粉菌基因組DNA 提取方法比較

柳利龍 ， 張愛琴 ， 張 環(huán)

（1.甘肅省農業(yè)科學院畜草與綠色農業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，甘肅 蘭州 730070）

黃瓜白粉病又稱粉霉病、白毛病，是嚴重危害黃瓜的主要病害之一，具有潛伏期短、再侵染頻繁、流行性強和周年發(fā)生等特點［1-3］。其主要為害葉片，影響葉片的光合作用，故通常在黃瓜生長過程中、后期發(fā)病重，造成黃瓜減產，甚至造成提前拉秧［4］。果實感染后不能正常膨大，呈瘦長形［5］，喪失商品價值。黃瓜白粉病病菌有2種，包括單囊殼白粉菌{Podosphaera xanthii［Sphaerotheca fuliginea（Schlecht）poll］}和二孢白粉菌［Golorinomyces cichoracearum（Erysiphe cichoracearum D C）］，我國黃瓜上多以單囊殼白粉菌Podosphaera xanthii為主［6］。2種白粉菌均屬于子囊菌，都是嚴格的專性寄生菌，寄主范圍廣泛，主要集中在黃瓜、西葫蘆、西甜瓜和南瓜等葫蘆科作物［3，7-9］。因其無性階段與報道的其他瓜類白粉菌結構非常相似，并且有性階段的閉囊殼不易產生，所以給病原物的分類、鑒定工作造成較大的困難［10］。因此，若要有效防治黃瓜白粉病，澄清其病原體的種類將非常重要。

近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，用提取白粉病病原菌無性生殖階段個體（分生孢子和菌絲）基因組DNA來鑒定、區(qū)分形態(tài)高度相似的白粉病病原菌，已成為重要的鑒定手段，其在形態(tài)鑒定基礎上，不僅提高了鑒定的準確性，還縮短了鑒定時間［10］。在分子生物學鑒定病原菌工作中，DNA提取至關重要。目前，基于白粉菌基因組DNA提取方法方面的研究較多。劉建利等［10］利用Chelex-100法建立了快速提取甜瓜白粉菌基因組DNA的高效方法；萬三連等［11-12］用3種方法提取了橡膠白粉菌基因組DNA，DNA產量OMEGA試劑盒法最高，生工生物試劑盒法最低，CTAB法介于兩者之間；龔雙軍等［13］采用改進破壁法、液氮研磨法和溶菌酶消化法進行破壁，利用改良CTAB法提取微量小麥白粉菌基因組DNA，改進的破壁方法獲得的DNA收率大且純度高；朱海榮等［14］利用4種方法提取相同質量小麥白粉菌基因組DNA，結果顯示提取率由大到小依次為改良CTAB法、電鉆微量研磨一管法、FastPrep DNA試劑盒法、Chelex-100法。基于黃瓜白粉菌基因組DNA提取方法的比較研究報道較少。黃瓜白粉菌為專性寄生菌，病菌須在活體上保存、培養(yǎng)和繁殖，而且在繁殖過程中易受寄主生長條件等因素的影響，收集足以提取DNA的孢子需花費較長的時間長且工作量大，篩選或開發(fā)出用盡可能少的孢子提取出高質量DNA的方法至關重要。我們利用改良CTAB法、SDS法和真菌試劑盒法提取黃瓜白粉菌基因組DNA并進行了比較，以期篩選出提取黃瓜白粉菌基因組DNA的最佳方法，為黃瓜白粉菌的分子生物學研究、系統(tǒng)發(fā)育分析及抗藥性分子機理等研究提供相應的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種：黃瓜品種“皇家101F1油亮型密刺黃瓜”（山東華諾種業(yè)有限公司），購于甘肅省農業(yè)科學院種子市場。

供試菌株：黃瓜白粉病菌采自實驗室內培養(yǎng)發(fā)病的黃瓜植株葉片。

供試藥劑：CTAB法提取緩沖液A（1.00 mol/L Tris-HCl， 0.50 mol/L EDTA， 20 g/L CTAB， 1.4 mol/L NaCl， pH 8.0）； SDS 法提取緩沖液B（0.05 mol/L Tris-HCl， 0.18 mol/L EDTA，10 g/L SDS，pH 8.0）。以上提取緩沖液均用無菌水配制，置于4 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃瓜白粉菌分生孢子收集 將黃瓜白粉菌分生孢子加入盛有0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS）水溶液中，在10×10倍顯微鏡下鏡檢使其濃度為每個視野約50～60個分生孢子。采用涂布法接種，將配制的孢子懸浮液均勻地涂抹在植株的所有子葉和真葉上［15］，接種量至每個葉片上都布滿孢子懸浮液為宜。然后將接種的幼苗置于溫度為25 ℃、RH 60%、光照12 h和光照強度為4 400 Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d后，待葉片上產生大量分生孢子時在超凈工作臺上收集白粉孢子。將已發(fā)病的黃瓜葉片慢慢用鑷子從培養(yǎng)基上取下放在琉璃紙上，輕輕用鑷子敲打2～3次，抖落大量的分生孢子后，再用細毛筆刷掉葉片上剩余的分生孢子，最后將收集到的所有白粉孢子刷進2 mL離心管中（可多次收集，每管中可分裝50～100 mg白粉孢子），每收集完一批，將超凈工作臺用酒精擦拭滅菌，打開紫外燈并風吹10 min，以保證菌種間不互相污染。將收集完孢子的離心管置于干燥器中干燥3～5 d，置于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黃瓜白粉病菌DNA的提取 改良CTAB法［16-17］。稱取黃瓜白粉菌分生孢子0.6 g于滅菌的研缽中，加入適量石英砂和液氮迅速研磨，重復2～3次，使成細粉末狀。用滅菌的鑰匙將研磨后的分生孢子粉末轉入1.5 mL離心管，依次加入750 μL DNA 提取緩沖液 A、 65 μL 10%CTAB、150 μL 2.5 mol/L NaCl、 50 μL 10%SDS 溶液， 反復顛倒離心管使其混勻（動作輕緩），在65 ℃條件下水浴1 h，期間輕輕震蕩3～4次。從水浴鍋中取出離心管，室溫下12 000 r/min離心8 min，取上清液于另一離心管中，并記錄體積。上清液中加入等體積的氯仿·異戊醇，12 000 r/min室溫下離心10 min，取上清液于另一離心管中，重復抽提1次。在上清液中加20 μL RNase酶，37 ℃水浴1 h；加入等體積的預冷無水乙醇，置于－20 ℃冰箱中3 h或過夜，沉淀DNA。取出離心管，12 000 r/min室溫下離心15 min，棄上清液。用70%乙醇和無水乙醇各洗1次（去除殘雜），在超凈工作臺上風干（40～60 min）；加入50 μL TE緩沖液溶解DNA，放入－20℃儲存或放入4 ℃下待用。

SDS法［18］。稱取黃瓜白粉菌分生孢子0.6 g于滅菌的研缽中，加入適量石英砂進行研磨，使成細粉末狀。用滅菌的鑰匙將研磨后的分生孢子粉末轉入2 mL離心管中，加入700 μL DNA提取緩沖液B，渦旋震蕩8～10 min，每隔30 s上下晃動10 s。在65 ℃條件下水浴90 min，期間輕輕顛倒離心管4～5次，加入600 μL 7.5 mol/L NH4AC，冰浴10 min。取出離心管于12 000 r/min，室溫下離心5 min，取上清液。上清液中加入1/10體積NaAC 3 mol/L和0.6倍體積預冷異丙醇，輕輕顛倒管子以混勻，冰浴20 min；12 000 rpm，室溫下離心5 min，取沉淀。取200 μL TE緩沖液溶解沉淀，加入適量RNase酶，37 ℃條件下水浴1 h。加入200 μL氯仿·異戊醇，取上清液于1.5 mL離心管，重復抽提1次。上清液加入1/10體積NaAC 3 mol/L 和2.5倍體積的預冷無水乙醇，最大轉速離心8 min，棄上清液。用75%乙醇和無水乙醇各洗1次去除殘雜，在超凈工作臺上風干（40～60 min）。加入50 μL TE緩沖液溶解DNA，放入－20 ℃下儲存或放入4 ℃下待用。

真菌試劑盒提取法，具體步驟參照DNA Fungal DNA Kit使用說明書。

1.2.3 提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測 將50×TAE緩沖液稀釋成1×TAE緩沖液來制備1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5 μL/mL溴化乙錠），電泳鑒定提取的DNA。取5 μL DNA，加入3 μL溴酚藍混勻，然后在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，一側加Marker（上海生工生產的DNA Marker D，分子量分別為 2 000、 1 000、 750、 500、 250、 100 bp）為分子量對照，于100 V下電泳30 min，在紫外光（254 nm）下觀察抽提結果，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.2.4 DNA質量體積分數(shù)及提取率計算 各取3 μL DNA稀釋（稀釋倍數(shù)為10），以稀釋所用超純水為對照，用CARY-50（Varian，美國）分光光度計測其在260 nm和280 nm波長處的光吸收值、R值（在1.8～2.0為高質量 DNA）［11，19-20］。

DNA 質量體積分數(shù)（μg/mL）=OD260×50×稀釋倍數(shù)

總DNA量（μg）= DNA濃度（μg/mL）×體積（mL）

DNA產量（μg/g）=總DNA量（μg）/菌重量（g）

R=A260/A280表示DNA在波長260 nm和280 nm處的吸光值比值。

2 結果與分析

2.1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

通過3種方法提取黃瓜白粉菌基因組總DNA，觀察白粉菌DNA電泳檢測條帶，結果表明，真菌試劑盒法提取的白粉菌DNA電泳檢測條帶（圖1 A，B，C）暗，雜質較多，有拖尾現(xiàn)象；SDS法提取的白粉菌DNA電泳檢測條帶（圖1D，E，F(xiàn)）較亮，但雜質較多，且部分有降解，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；CTAB法提取的白粉病菌DNA較為完整，電泳檢測條帶（如圖1 G，H，I）清晰，亮度高，基本無拖尾現(xiàn)象。3種方法提取的白粉菌DNA電泳檢測條帶亮度依次為CTAB法、SDS法、真菌試劑盒法。

圖1 黃瓜白粉病菌基因組DNA凝膠成像電泳圖

2.2 DNA濃度及提取產率分析

測定了黃瓜白粉菌DNA的A260和A280，結果表明，3種方法獲得的DNA無論從數(shù)量還是質量上都有顯著區(qū)別（表1）。CTAB法和SDS法提取白粉菌DNA質量較高，其R值均大于1.8，分別為1.969 6和1.832 2；而真菌試劑盒法提取得白粉菌DNA質量較低，其R值小于1.8，為1.507 9。用CTAB法提取到的 DNA產量達 204.30 μg/g，比SDS法（產量147.70 μg/g）的效率高出38.3%， 比真菌試劑盒法（產量118.70 μg/g）的效率高出72.1%，且各方法提取的DNA產量之間差異極顯著（P<0.01）。綜上所述，3種方法提取的白粉菌DNA產量和質量由大到小依次為CTAB法、SDS法、真菌試劑盒法。

表1 不同方法提取黃瓜白粉菌DNA的測定結果

3 小結與討論

分別利用改良CTAB法、SDS法和真菌試劑盒法提取了黃瓜白粉菌基因組DNA。通過比較分析，發(fā)現(xiàn)利用CTAB法提取的白粉菌DNA效果最佳，其次分別為SDS法和真菌試劑盒法。CTAB法提取的黃瓜白粉菌基因組DNA在純度（R=A260nm/A280nm）和產量上均優(yōu)于SDS法和真菌試劑盒法，且雜質少。CTAB法提取的黃瓜白粉菌基因組DNA產率為204.30 μg/g，而SDS法和真菌試劑盒法為147.70 μg/g、 117.70 μg/g， 且方法產率之間差異極顯著。采用CTAB法提取的DNA純度較高為1.969 6，SDS法和真菌試劑盒法較低分別為1.832 2和 1.507 9。

CTAB法在提取白粉菌基因組DNA過程中，研磨之前加入適量石英砂，同時還加液氮進行了速凍，因此破壁效果更好，獲得的DNA產量最高，同時整個提取過程中不需多次抽提，步驟簡單、成本低、提取的質量高，適合提取黃瓜白粉菌這種菌體較輕、難收集、易飛濺的專性寄生菌的DNA，這與龔雙軍等［13］、朱海榮等［14］提取小麥白粉菌基因組DNA時篩選出的方法相一致。改進的SDS法提取的黃瓜白粉菌基因組DNA，研磨前只加石英砂進行研磨，同時使用渦旋振蕩器充分振蕩混勻，雖避免了在提取過程中DNA的損失，但破壁效果較差，導致提取的DNA純度和產量均較低。真菌試劑盒法破壁方法和CTAB法一樣，但提取的DNA產量和質量較CTAB法低，這可能是裂解液的裂解不充分或其他方面的原因而影響了核酸釋放。

［1］張圣平，劉苗苗，苗 晗，等．黃瓜白粉病抗性基因的 QTL 定位［J］．中國農業(yè)科學， 2011， 44（17）：3584-3593.

［2］孫中亞．黃瓜白粉病及防治［J］．現(xiàn)代農業(yè)，2012（5）： 65.

［3］周生茂，班美玲，尚小紅，等．瓜類蔬菜白粉病及其抗性分子遺傳的研究進展［J］．浙江農業(yè)學報，2013，25（6）： 1456-1461.

［4］徐寶星．無公害大棚黃瓜白粉病的防治技術措施［J］．河北農業(yè)， 2005（5）： 14．

［5］劉政興．大棚溫室黃瓜白粉病的發(fā)生與防治［J］．現(xiàn)代農業(yè)科技， 2005（2）： 18-19．

［6］劉盼娜．黃瓜莖蔓抗白粉病基因的定位研究［D］．北京：中國農業(yè)科學院，2016.

［7］XU X， YU T， YU R， et al.Fine mapping of a dominantly inherited powdery mildew resistance major-effect QTL，Pm1.1，in cucumber identifies a 41.1 kb region containing two tandemly arrayed cysteine-rich receptorlike protein kinase genes［J］.Theoretical and Applied Genetics， 2016， 129（3）： 507-516.

［8］劉秀波，崔 琦，崔崇士，等．瓜類白粉病抗性育種研究進展［J］．東北農業(yè)大學學報， 2005， 36（6）： 794-798．

［9］曲 麗，秦智偉．黃瓜白粉病病原菌及抗病性研究進展［J］．東北農業(yè)大學學報， 2007， 38（6）： 835-841.

［10］劉建利，趙海霞.Chelex-100法快速提取甜瓜白粉病菌基因組 DNA［J］. 北方園藝， 2010（10）： 167-169.

［11］萬三連，梁 鵬，宋風雅，等.橡膠樹白粉菌收集及DNA和RNA提取方法比較［J］.廣東農業(yè)科學，2013（11）： 134-139.

［12］毛宇寧，梁 鵬，劉文波，等.橡膠樹白粉菌分子檢測技術的建立［J］. 植物保護， 2016， 42（4）： 119-123.

［13］龔雙軍，楊立軍，劉 輝，等.1種小麥白粉病菌DNA基因組的微量簡介提取方法［J］.微生物學雜志， 2011，31（1）： 24-27.

［14］朱海榮，段霞瑜，周益林，等.小麥白粉病菌基因組DNA的微量提取及ISSR-PCR反應體系的優(yōu)化［J］. 植物保護， 2010， 36（3）： 125-129.

［15］司乃國，劉君麗.新型廣譜殺菌劑烯肟菌胺//中國植物病害化學防治研究研究（第四卷）［C］.北京：中國農業(yè)科學技術出版社，2004：37-42.

［16］江 潔，杜連祥，路福平，等.基因工程菌里氏木霉染色體 DNA的提取方法［J］.生物技術，2004，14（2）： 24-26.

［17］NIU C， KEBEDE H，AULD D L， et al.A safe inexpensive method to isolate high quality plant and fungal DNA in an open laboratory environment［J］.African Journal of Biotechnology， 2008， 7（16）： 2818-2822.

［18］遲文娟.東北小麥白粉病菌群體遺傳結構與分子檢測技術研究［D］.沈陽：沈陽農業(yè)大學，2009.

［19］奧斯伯F，金斯頓R E，塞得曼J G，等.精編分子生物學實驗指南［M］.顏子穎，王海林，譯.北京：科學出版社，1998：831-833.

［20］劉 丹，劉太國，張 敏，等.小麥光腥黑粉菌冬孢子總DNA提取方法比較［J］.植物保護，2006，32（2）： 93-95.