LC-MS/MS法測(cè)定Beagle犬血漿中ET-26鹽酸鹽及其代謝產(chǎn)物ET-acid

劉美玲， 陳星宇， 趙志玲， 張文勝， 徐小平， 錢廣生

(1. 四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041; 2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院 轉(zhuǎn)化科學(xué)中心麻醉與危重急救研究室，四川 成都 610041)

0 引 言

ET-26鹽酸鹽是短效麻醉藥物依托咪酯(Etomidate )的新類似物，它是由依托咪酯經(jīng)過水解，酯化而形成的活性咪唑類衍生物[1]。ET-26鹽酸鹽與依托咪酯有類似的藥理特點(diǎn)，具有全身麻醉和鎮(zhèn)靜作用，且起效快、蘇醒迅速，對(duì)心血管的穩(wěn)定性好[2]，還很大程度上克服了依托咪酯的腎上腺素抑制作用[3]。目前對(duì)于生物樣品中ET-26鹽酸鹽的含量檢測(cè)方法報(bào)道較少，有文獻(xiàn)報(bào)道用容量法[4]對(duì)ET-26鹽酸鹽進(jìn)行檢測(cè)，該方法雖簡(jiǎn)便，但是靈敏度較低，不適合用于生物樣品的檢測(cè)。也有文章使用GC-MS[5]對(duì)ET-26鹽酸鹽進(jìn)行檢測(cè)，ET-26鹽酸鹽在制備過程中易產(chǎn)生有關(guān)物質(zhì)依托咪酯酸及依托咪酯，影響ET-26鹽酸鹽的分離測(cè)定，該方法未能對(duì)其雜質(zhì)依托咪酯酸進(jìn)行分離檢測(cè)，且方法靈敏度低，難以滿足臨床上個(gè)體血藥濃度監(jiān)測(cè)的需求。楊?yuàn)檴櫟萚1]用HPLC方法成功分離了依托咪酯酸、依托咪酯及ET-26鹽酸鹽，也為本研究分離依托咪酯酸和ET-26鹽酸鹽提供了參考。依托咪酯的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[6-8]、氣相色譜法[9-10]、氣質(zhì)聯(lián)用[11-12]等。由于ET-26鹽酸鹽與依托咪酯結(jié)構(gòu)相似，可參考測(cè)定生物樣品中的依托咪酯的方法?？紤]到生物樣本中血藥濃度低，且樣本成分復(fù)雜，僅用高效液相色譜法難以達(dá)到生物樣本中檢測(cè)靈敏度和專屬性的要求，本課題擬采用具有高靈敏度和高選擇性的液相-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定血漿中ET-26鹽酸鹽的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Agilent 1200 高效液相色譜儀；Agilent G6460型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（Agilent Mass-Hunter工作站）；Beckman P/ACE MDQ儀（Beckman 32 Karat工作站，Beckman Coulter公司）；十萬(wàn)分之一電子分析天平（Sartorious ME215s，Sartorious CPA225D）；pH計(jì)（METTLER-TOLEDO，320pH meter，Metter-Toledo儀器上海有限公司）；漩渦混勻儀（IKA MS3 basic）；MILLI-Q超純水純化儀；CHMEDA Excel 210SE型麻醉機(jī)（美國(guó)CHMEDA公司）：PHILIPS 150B3監(jiān)護(hù)儀（蘇州飛利浦消費(fèi)電子有限公司）；BL-420E+型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

氨水、乙酸、甲酸、無(wú)水乙醇、甲醇、乙腈均為色譜純。ET-26鹽酸鹽對(duì)照品（20140218，含量99.57%），實(shí)驗(yàn)室精制；依托咪酯酸對(duì)照品（20140211批，含量91.40%），實(shí)驗(yàn)室自制；依托咪酯（101131-201001），依托咪酯雜質(zhì)C{1-methylethyl 1-[(1RS)-1-phenylethyl]-1H-imidazole-5-carboxylate}，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

成年健康Beagle犬9只，體重7～10 kg（由四川省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供）。

1.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液與內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱取ET-26鹽酸鹽對(duì)照品、依托咪酯酸對(duì)照品各10 mg，至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，4 ℃保存?zhèn)溆?。取依托咪酯雜質(zhì)C（內(nèi)標(biāo)）11 mg，至50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，4 ℃保存?zhèn)溆?。?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液臨用前用乙腈稀釋至11 ng/mL，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3 血漿樣品的預(yù)處理

取血漿樣品100 μL置于1.5 mL EP管中，加入含乙腈的內(nèi)標(biāo)溶液400 μL，渦旋混勻2 min(2 500 r/min) ，離心20 000g× 10 min，取上清液100 μL于1.5 mL EP管中，加入等體積的無(wú)水乙醇，渦旋混勻2 min (2 500 r/min)， 取上清液5 μL進(jìn)樣分析。

1.4 色譜條件

分析柱：Agilent Extend-C18 (3.0 mm × 100 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：水（0.01% NH3，用乙酸調(diào)pH至9.0）-乙腈，體積比 35:65；流量：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣盤溫度：10 ℃；洗針液體：乙醇-水（體積比 3:1），洗針10 s；進(jìn)樣體積：5 μL；進(jìn)樣溶液：乙腈-乙醇（體積比 1:1）。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：ESI 源；霧化氣和輔助氣 ：氮?dú)?；離子源溫度：300 ℃；氣體流量：5 L/min；噴霧器壓力：45 psi（1 psi = 6.895 kPa）；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流量：11 L/min；毛細(xì)管電壓：3500 V；輔助電壓：500 V；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM) ，正離子模式；用于定量分析的檢測(cè)離子對(duì)為：ET-26鹽酸鹽，m/z275.3/105.1； 依托咪酯酸，m/z217.0/113.1；依托咪酯雜質(zhì)C（內(nèi)標(biāo)），m/z259.0/155.1。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇及優(yōu)化

2.1.1 沉淀劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)篩選了甲醇、乙腈、乙醇作為沉淀劑，通過依托咪酯酸的峰面積，考察沉淀效果。其中乙腈沉淀蛋白效果最好，甲醇和乙醇沉淀蛋白絮狀物較多，考慮到進(jìn)樣溶劑為乙腈-乙醇（1:1），故進(jìn)一步考察了乙腈:乙醇體積比1:1，4:1，9:1為沉淀劑的沉淀效果，結(jié)果顯示單獨(dú)以乙腈為沉淀劑，效果最好。

2.1.2 沉淀劑體積的選擇

通過依托咪酯酸的峰面積，考察乙腈與血漿體積比分別為1:2，1:3，1:4時(shí)蛋白的沉淀效果。結(jié)果表明，血漿:乙腈（1:4）沉淀最干凈，且峰面積響應(yīng)值最大，故以此為蛋白沉淀劑。

2.2 色譜條件的選擇及優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

對(duì)于+ESI離子源，流動(dòng)相一般采用10 mmol/L的甲酸或者乙酸溶液，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用甲酸或者乙酸等偏酸性溶液會(huì)使得ET-26鹽酸鹽部分解離，存在分子型和離子型兩種形式[13]，導(dǎo)致基線不穩(wěn)，從而影響測(cè)定結(jié)果。結(jié)合本品色譜條件在偏堿性條件下分離效果較好，考察了0.01% NH3（乙酸調(diào)節(jié)pH至8.0，9.0，10.0）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B時(shí)，基線的漂移情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相改為堿性后ET-26鹽酸鹽不會(huì)解離，且基線平穩(wěn)。同時(shí)，流動(dòng)相B的pH為9.0時(shí)，峰形較好。流動(dòng)相體積比A:B =35:65時(shí)，各色譜峰分離較好，且出峰時(shí)間合適。

2.2.2 進(jìn)樣溶液的選擇

分別考察乙腈、甲醇、乙醇、乙腈-水(1:1)、乙腈-甲醇(1:1)、乙腈-乙醇(1:1)為進(jìn)樣溶液時(shí)，各色譜峰的峰形以及分離情況。結(jié)果表明，以乙腈為進(jìn)樣溶液時(shí)，由于溶劑與初始流動(dòng)相極性差異較大，依托咪酯酸容易分裂成兩個(gè)峰，以甲醇，乙醇為進(jìn)樣溶液時(shí)，依托咪酯酸的響應(yīng)值較小。乙腈與乙醇的混合溶液為進(jìn)樣溶液時(shí)峰面積響應(yīng)最大，且峰形較好。

進(jìn)一步考察了乙腈與乙醇不同混合比例對(duì)依托咪酯酸峰面積響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明乙腈-乙醇(1:1)為進(jìn)樣溶液時(shí)，依托咪酯酸響應(yīng)值及峰形最好，因此將其作為最終進(jìn)樣溶液。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化

2.3.1 ET-26鹽酸鹽定量離子對(duì)的選擇

在+ESI離子化方式下，進(jìn)行ET-26鹽酸鹽的母離子掃描（Q1 scan），產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子[M+H]+峰：m/z275.3，在子離子掃描（product ion scan）模式下掃描子離子，選取豐度最高、信號(hào)最強(qiáng)的子離子：m/z171.1作為定量離子對(duì)。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)若采用這一豐度最大的離子對(duì)進(jìn)行定量，ET-26鹽酸鹽極易在色譜柱上殘留，而其豐度值稍小的離子對(duì)m/z275.3/105.1也能達(dá)到相應(yīng)的響應(yīng)要求且不易在色譜柱上殘留，故最終選擇了m/z275.3/105.1為MRM定量的離子對(duì)。采用Agilent G6460型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀自帶的Agilent Optimizer工作站自動(dòng)優(yōu)化功能優(yōu)化所有質(zhì)譜參數(shù)以獲得較高的靈敏度。

2.3.2 依托咪酯酸定量離子對(duì)的選擇

實(shí)驗(yàn)采用流動(dòng)相：水（0.01% NH3，用乙酸調(diào)pH至9.0）-乙腈（35:65），對(duì)依托咪酯酸進(jìn)行母離子掃描（Q1 scan），產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子[M+H]+峰：m/z217.0，然后在子離子掃描（product ion scan）模式下掃描子離子，選取豐度最高、信號(hào)最強(qiáng)的子離子：m/z113.1，采用Agilent G6460型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀自帶的Agilent Optimizer工作站自動(dòng)優(yōu)化功能優(yōu)化所有質(zhì)譜參數(shù)以獲得較高的靈敏度。

2.3.3 內(nèi)標(biāo)的選擇

生物樣品測(cè)定中，由于前處理步驟較多，容易引入較大的誤差，因此引入內(nèi)標(biāo)十分必要。本實(shí)驗(yàn)選擇的內(nèi)標(biāo)有英國(guó)藥典上的依托咪酯、美托咪酯（依托咪酯雜質(zhì)B）、依托咪酯雜質(zhì)C。其結(jié)構(gòu)均與待測(cè)物ET-26鹽酸鹽及其代謝產(chǎn)物依托咪酯酸（依托咪酯雜質(zhì)A）結(jié)構(gòu)類似。依托咪酯的總離子流色譜圖（m/z245.0/141.0，碎裂電壓80 V，碰撞能量4 eV）的保留時(shí)間tR為16.5 min，相較于待測(cè)物ET-26鹽酸鹽的保留時(shí)間tR更長(zhǎng)，延長(zhǎng)了分析時(shí)間。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，美托咪酯在24h內(nèi)不能在樣品中穩(wěn)定存在，容易分解。而依托咪酯雜質(zhì)C與待測(cè)物ET-26鹽酸鹽可以完全分離，出峰時(shí)間較快，且其在10 ℃條件下可以穩(wěn)定保存24 h，因此最終選擇依托咪酯雜質(zhì)C作為內(nèi)標(biāo)。對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化后最優(yōu)定量離子對(duì)為m/z259.0/155.1。

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

平行取來(lái)自6個(gè)不同個(gè)體的正常Beagle犬空白血漿，均同時(shí)加入ET-26鹽酸鹽、依托咪酯酸及依托咪酯雜質(zhì)C，按照1.3項(xiàng)下方法處理。另取Beagle犬靜脈注射定量ET-26鹽酸鹽10 min后所得血漿樣品，按照1.3項(xiàng)下方法處理，在選定的色譜條件測(cè)定，結(jié)果如圖1～圖3所示，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定無(wú)干擾。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍與定量限、檢測(cè)限

圖1 空白血漿處理后依托咪酯酸、ET-26鹽酸鹽、內(nèi)標(biāo)總離子流色譜圖

圖2 空白血漿加依托咪酯酸、ET-26鹽酸鹽，依托咪酯雜質(zhì)C處理后總離子流色譜圖

圖3 Beagle犬靜脈注射定量ET-26鹽酸鹽10 min后所得血漿樣品處理后總離子流色譜圖

取正常Beagle犬空白血漿80 μL各8份，分別加入質(zhì)量濃度為20 900，10 450，3 483，1 161，387.0，129.0，64.51，32.25 ng/mL的ET-26鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，質(zhì)量濃度為21 080，10 540，3 513，1 171，390.4 ，130.1 ，65.06，32.53 ng/mL的依托咪酯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，分別按1.3項(xiàng)處理，并按優(yōu)化的色譜質(zhì)譜方法檢測(cè)。以血漿濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果表明ET-26鹽酸鹽，依托咪酯酸分別在3.225～2 090 ng/mL和3.253～2 108 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，其線性回歸方程分別為y= 0.008 13x- 0.005 64 (r= 0.999 8)，y= 0.005 1x+ 0.026 55 (r= 0.999 8)。取主峰峰高約為基線噪聲的10倍（S/N= 10）作為定量限，ET-26鹽酸鹽、依托咪酯酸定量限分別為3.225 ng/mL、3.253 ng/mL。取主峰峰高約為基線噪聲的3倍（S/N= 3）作為檢測(cè)限，ET-26鹽酸鹽、依托咪酯酸的檢測(cè)限分別為0.970 0 ng/mL、1.000 ng/mL。

2.6 回收率考察

取9份正常Beagle犬空白血漿80 μL，分別加入低中高3個(gè)濃度的ET-26鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（129.0，1 161，10 450 ng/mL）和依托咪酯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（130.1，1 171，10 540 ng/mL）各10 μL，設(shè)3個(gè)平行。同時(shí)取9份同等體積的乙腈溶液80 μL，加樣情況同上。按照1.3 項(xiàng)下血漿樣品的預(yù)處理方法處理，以空白加標(biāo)血漿中待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的比值A(chǔ)i除以乙腈溶液中待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的比值A(chǔ)s，其結(jié)果作為回收率考察。結(jié)果表明 Beagle 犬血漿中ET-26鹽酸鹽低，中，高濃度回收率分別為86.57% ± 3.3%，90.25% ± 0.57%，105.03% ± 0.90%；依托咪酯酸的低，中，高濃度回收率分別為96.54% ± 1.4%，95.94% ± 0.87%，98.27% ± 0.53%，結(jié)果表明該方法回收率高。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)

取9份正常Beagle犬空白血漿80 μL，分別置于1.5 mL EP管中，加空白乙腈溶液400 μL，渦旋混勻2 min(2 500 r/min) ，離心20 000g× 10 min ，取上清液置于1.5 mL EP管中，氮?dú)獯蹈桑尤牒译娴膬?nèi)標(biāo)溶液400 μL復(fù)溶，再加入80 μL純乙腈。分別加入低中高3個(gè)濃度的ET-26鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（129.0，1 161，10 450 ng/mL）和依托咪酯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（130.1，1 171，10 540 ng/mL）各10 μL，作為A組，設(shè)3個(gè)平行。

同時(shí)取9份同等體積的乙腈溶液80 μL置于1.5 mL EP管中，加入含乙腈的內(nèi)標(biāo)溶液400 μL，分別加入低中高3個(gè)濃度的ET-26鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（129.0，1 161，10 450 ng/mL）和依托咪酯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（130.1，1 171，10 540 ng/mL）各10 μL，作為B組，設(shè)3個(gè)平行。兩組樣品均按照1.3項(xiàng)下樣品的預(yù)處理方法，取上清液5 μL 進(jìn)樣分析。測(cè)得ET-26鹽酸鹽的低、中、高3種濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別是88.13% ± 4.2%，89.21% ± 2.5%，91.42% ± 2.6%；依托咪酯酸的低、中、高3種濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別是86.10% ± 5.3%，88.52% ± 3.5%，90.35% ± 2.5%，結(jié)果表明基質(zhì)效應(yīng)不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定。

2.8 日內(nèi)、日間精密度

取18份正常Beagle犬空白血漿80 μL，分別加入低中高3個(gè)濃度的ET-26鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（129.0 ，1 161，10 450 ng/mL）、依托咪酯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（130.1，1 171，10 540 ng/mL）各10 μL，每種濃度的樣品各6份。連續(xù)3 d制備樣品，測(cè)定3批樣品精密度。按照1.3 項(xiàng)下處理后進(jìn)樣，計(jì)算血漿中ET-26鹽酸鹽和依托咪酯酸峰面積與內(nèi)標(biāo)的比值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得實(shí)測(cè)濃度。計(jì)算日內(nèi)和日間的精密度。測(cè)定結(jié)果如表1～表3所示。

表1 Beagle犬血漿中ET-26鹽酸鹽日內(nèi)精密度測(cè)定結(jié)果（ n = 6）

表2 Beagle犬血漿中依托咪酯酸日內(nèi)精密度測(cè)定結(jié)果（ n = 6）

表3 Beagle犬血漿中ET-26鹽酸鹽、依托咪酯酸日間精密度測(cè)定結(jié)果

2.9 穩(wěn)定性考察

2.9.1 儲(chǔ)備液長(zhǎng)期冷藏放置的穩(wěn)定性

將ET-26鹽酸鹽儲(chǔ)備液（1.045 mg/mL）、依托咪酯酸儲(chǔ)備液（1.054 mg/mL）于4 ℃條件下放置7，14，30 d 后，按照1.2項(xiàng)下，稀釋后進(jìn)樣分析，以考察儲(chǔ)備液長(zhǎng)期冷藏的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，ET-26鹽酸鹽儲(chǔ)備液于4 ℃條件下放置30 d后的平均偏倚率為-0.33%，依托咪酯酸鹽儲(chǔ)備液于4 ℃條件下放置30 d后的平均偏倚率為0.28%，故儲(chǔ)備液可在4 ℃條件下放置30 d。

2.9.2 樣品處理前冰凍（-80 ℃）的穩(wěn)定性

考察樣品處理前在-80 ℃下放置的穩(wěn)定性，即取配置好的含低、中、高3種濃度的空白血漿加標(biāo)樣品，在-80 ℃下放置，分別于第15 d、30 d取樣測(cè)定。測(cè)定結(jié)果顯示，ET-26鹽酸鹽和依托咪酯酸的低、中、高濃度變化的RSD值均在3.8% ～ 7.8%之間，說明該樣品處理前可在-80 ℃條件下放置30 d。

2.9.3 樣品處理前凍融穩(wěn)定性

取配制好的低、中、高3種濃度空白血漿加標(biāo)樣品，分別在室溫與-80 ℃條件下反復(fù)凍融3次后取樣分析。ET-26鹽酸鹽和依托咪酯酸的低、中、高濃度變化的RSD分別在5.3% ～ 7.3%和2.7% ～7.4%之間，說明該樣品處理前凍融穩(wěn)定性良好。

2.10 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

取9只成年Beagle犬禁食12 h，分為高、中、低3組，分別靜脈注射給藥7.68，3.84，1.92 mg/kg，給藥后均在0.5，1，2，3，4，5，10，20，30，60，120，180，240，300 min后采集靜脈血0.8 mL于編號(hào)后的離心管中，迅速加入40 μL氟化鈉（40 mg/mL），上下翻轉(zhuǎn)混合，3 500 r/min離心15 min制備血漿，取出上層血漿，分兩份轉(zhuǎn)入1.5 mL的EP管中，于-80 ℃保存。待測(cè)血漿按照1.3 項(xiàng)下處理后進(jìn)樣，并計(jì)算每個(gè)血漿樣本的血藥濃度，其高、中、低濃度藥時(shí)曲線如圖4～圖6所示。實(shí)驗(yàn)中所測(cè)得的所有血藥濃度數(shù)據(jù)，用DAS3.2.1軟件進(jìn)行優(yōu)度選擇和房室模型擬合。給藥劑量為1.92，3.84，7.68 mg/kg時(shí)的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分別為：t1/2=78.96，36.51，32.947 min； AUC（0-t）= 46.09，570，565.3 μg·L-1·min；AUC（0-∞）= 47.70，577，567.9 μg·L-1·min；表觀分布容積V= 4 369，351.1，591.85 L/kg；CL = 40.95，6.67，12.449 L/（min·kg）。

圖4 Beagle犬高劑量組血漿藥物（ET-26鹽酸鹽）濃度-時(shí)間圖（Dose: 7.68 mg/kg）

圖5 Beagle犬中劑量組血漿藥物（ET-26鹽酸鹽）濃度-時(shí)間圖（Dose: 3.84 mg/kg）

3 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)成功建立了用LC-MS/MS準(zhǔn)確測(cè)定Beagle犬血漿中ET-26鹽酸鹽及其代謝產(chǎn)物依托咪酯酸的實(shí)驗(yàn)方法。該方法在+ESI離子化方式下，以依托咪酯雜質(zhì)C的定量離子對(duì)為m/z259.0/155.1為內(nèi)標(biāo)，通過檢測(cè)ET-26鹽酸鹽的碎片離子m/z275.3/105.1進(jìn)行MRM定量。該方法穩(wěn)定性良好，提取回收率高，內(nèi)源性雜質(zhì)無(wú)干擾，基質(zhì)不影響檢測(cè)結(jié)果，能有效應(yīng)用于Beagle犬血漿中ET-26鹽酸鹽及其代謝產(chǎn)物依托咪酯酸的定量檢測(cè)。

圖6 Beagle犬低劑量組血漿藥物（ET-26鹽酸鹽）濃度-時(shí)間圖（Dose: 1.92 mg/kg）

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