竹蓀連作土壤拮抗細(xì)菌的分離鑒定及抑菌活性

張?jiān)轮? 蔣文靜 常穎萃 牛蓉 葉舟

摘 要 通過(guò)分離鑒定竹蓀連作土壤中拮抗細(xì)菌，研究其抑菌作用。采用稀釋平板涂布法，通過(guò)形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA測(cè)序分析等方法分離、鑒定竹蓀菌拮抗細(xì)菌，用平板對(duì)峙試驗(yàn)探究該菌對(duì)竹蓀菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果表明，從竹蓀連作地土壤中分離出1株對(duì)竹蓀菌絲生長(zhǎng)具有明顯抑制作用的菌株。經(jīng)鑒定，該菌株為巨大芽孢桿菌。平板對(duì)峙試驗(yàn)表明，該菌及其發(fā)酵液均對(duì)竹蓀菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用，抑制率分別為58.37%、64.81%，而經(jīng)高溫滅菌和過(guò)濾膜除菌后的發(fā)酵液對(duì)竹蓀菌絲生長(zhǎng)的抑制率大大降低，說(shuō)明發(fā)酵液所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可能是一種對(duì)高溫敏感的蛋白質(zhì)，該結(jié)論為竹蓀連作障礙的全面解析提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 竹蓀 ；巨大芽孢桿菌 ；抑菌活性 ；連作障礙

中圖分類號(hào) S482.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.01.016

Abstract This study screened out antagonistic bacteria in continuous cropping soil of dictyophora and analyzed its antibacterial activity. The bacteria were isolated by plate dilution method and the strains were identified by microscopic observations， biological identification and 16S rDNA sequence analysis. The plate confrontation test were used to analyze the anti-microbial activity.The results showed that there was one bacteria showed great antibacterial activity on dictyophora. The bacteria was Bacillus megatherium. The plate confrontation test showed that Bacillus megatherium and its fermentation broth had inhibiting effect on the growth of dictyophora with the efficacy of 58.37% and 64.81%. However， biological inhibition was greatly declined when the fermented liquid was sterilized with high temperature and aseptic filtration.The antibacterial was a kind of protein which was sensitive to the high temperature. This paper could provide theoretical basis for the consecutive monoculture problems of Dictyophora.

Keywords Dictyophora echinovolvata ； Bacillus megatherium ； anti-microbial activity ； consecutive monoculture problem

竹蓀（Dictyophora）屬于真菌，是對(duì)竹蓀屬（Dictyophora Desv）的總稱，別名竹笙、竹菌、竹參、網(wǎng)紗菇、竹簽，為名貴的食用菌。近年來(lái)，福建、湖南、貴州等省的竹蓀栽培生產(chǎn)發(fā)展迅速，栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量不斷提高，竹蓀栽培已成為當(dāng)?shù)靥厣a(chǎn)業(yè)和重要經(jīng)濟(jì)來(lái)源。但連作障礙問(wèn)題使得二茬竹蓀產(chǎn)量下降，持續(xù)連作減產(chǎn)幅度更大，嚴(yán)重影響竹蓀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

農(nóng)作物連作障礙一般為諸多因素綜合影響的結(jié)果[1]。首先，土壤的肥力與農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)存在著密切的關(guān)系[2]。其次，作物生長(zhǎng)過(guò)程中，根系常會(huì)分泌對(duì)自身有害的化合物[3-4]，且長(zhǎng)期連作，根系的微生物群落會(huì)發(fā)生變化或者結(jié)構(gòu)被打破，病原微生物數(shù)量增加，影響作物的正常生長(zhǎng)與發(fā)育[5-8]。因食用菌栽培生產(chǎn)連作障礙的特點(diǎn)、發(fā)生機(jī)制有別于植物連作障礙，竹蓀連作土壤中是否存在竹蓀菌的拮抗細(xì)菌，竹蓀菌與土壤拮抗細(xì)菌的互作是否為竹蓀連作障礙的重要原因，目前都尚未見(jiàn)相關(guān)研究。但在某些地區(qū)，連作障礙問(wèn)題已嚴(yán)重影響食用菌產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本文通過(guò)對(duì)竹蓀連作土壤竹蓀菌拮抗細(xì)菌的分離鑒定及抑菌作用進(jìn)行研究，探討竹蓀連作土壤拮抗細(xì)菌與竹蓀菌的互作關(guān)系，旨在為竹蓀連作障礙的全面解析提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 竹蓀連作土壤樣

2009年4月，采集福建省南平市順昌縣大歷鄉(xiāng)竹蓀產(chǎn)區(qū)連作地塊土壤樣，采樣深度5～15 cm。采樣后立即將土壤樣帶回實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干，過(guò)2 mm篩，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試竹蓀菌株

棘托竹蓀89 菌株：由福建農(nóng)林大學(xué)菌草研究所提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

采用LB固體培養(yǎng)基分離純化巨大芽孢桿菌；采用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行巨大芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)；采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行竹蓀菌培養(yǎng)及與巨大芽孢桿菌的平板對(duì)峙試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 竹蓀菌拮抗細(xì)菌的分離純化

稱取20 g土壤樣品，加入盛有100 mL無(wú)菌水的三角瓶中（含玻璃珠），l40 r/min振蕩20 min，靜置。取1 mL上清液，系列稀釋至1×l0-9，將梯度稀釋好的上清液進(jìn)行平板涂布，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落，平板劃線法純化，純菌株移入斜面，保存?zhèn)溆?。以竹蓀菌為指示菌，將分離的細(xì)菌菌株采用平板對(duì)峙生長(zhǎng)法進(jìn)行拮抗性篩選，選出對(duì)竹蓀菌生長(zhǎng)有抑制作用的菌株，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的初步鑒定

將篩選獲得的菌株接種在LB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)。革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。對(duì)該菌株進(jìn)行過(guò)氧化氫酶反應(yīng)、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、卵黃試驗(yàn)、淀粉水解、葡萄糖發(fā)酵等生理生化試驗(yàn)[9]。

取適量的培養(yǎng)菌落，提取DNA，根據(jù)細(xì)菌的16S rDNA核苷酸系列引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序，并與BLAST進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 拮抗細(xì)菌發(fā)酵液的制備

將竹蓀菌拮抗細(xì)菌接種于裝有150 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃ 120 r/min培養(yǎng)24 h后，發(fā)酵液于4℃沉淀24 h。一部分發(fā)酵液高壓滅菌（121℃，0.1 MPa）處理20 min，作為高溫處理拮抗細(xì)菌發(fā)酵液；另一部分用0.22 μm的細(xì)菌濾膜去菌體，作為無(wú)細(xì)胞拮抗細(xì)菌發(fā)酵液[10-11]。

1.2.4 竹蓀菌拮抗細(xì)菌發(fā)酵液蛋白粗提液的制備

將已活化的竹蓀菌拮抗細(xì)菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃120 r/min培養(yǎng)20 h，4℃ 8 000 r/min離心10 min，取上清液，加入固體硫酸銨至飽和，4℃沉淀24 h，10 000 r/min離心10 min，棄除上清液，取沉淀用5 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.0）懸浮[12-13]。

1.2.5 竹蓀菌拮抗細(xì)菌對(duì)竹蓀菌絲生長(zhǎng)影響的測(cè)定

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，用直徑為6 mm的打孔器取生長(zhǎng)良好的竹蓀菌菌塊，接入PDA平板一側(cè)，于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。取培養(yǎng)后生長(zhǎng)良好的竹蓀菌，在距竹蓀菌塊邊緣2 cm 處劃線接入活化24 h 的竹蓀菌拮抗細(xì)菌，不接竹蓀菌拮抗細(xì)菌為對(duì)照，3次重復(fù)。24℃恒溫繼續(xù)培養(yǎng)，待竹蓀菌長(zhǎng)到培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，測(cè)定抑菌寬度，計(jì)算抑菌率（ 抑菌寬度用十字交叉劃線法測(cè)量）[14]。

抑菌率=[（對(duì)照竹蓀菌菌落直徑-處理竹蓀菌菌落直徑）/對(duì)照竹蓀菌菌落直徑]×100%[15]

1.2.6 竹蓀菌拮抗細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)竹蓀菌絲生長(zhǎng)影響的測(cè)定

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，在各PDA平板上分別放置一個(gè)無(wú)菌的牛津杯，在距離牛津杯2 cm 處接種竹蓀菌塊（d=6 cm），將竹蓀菌拮抗細(xì)菌發(fā)酵液、過(guò)濾除菌發(fā)酵液、高溫滅菌發(fā)酵液各150 μL 分別加入牛津杯中，以牛津杯中加入無(wú)菌水作為對(duì)照，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，于4℃冰箱中放置12 h 后，置24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對(duì)照組菌絲長(zhǎng)至平板邊緣時(shí)，測(cè)定抑抑菌寬度，計(jì)算抑菌率[16]。

1.2.7 竹蓀菌拮抗細(xì)菌發(fā)酵液蛋白粗提液對(duì)竹蓀菌絲生長(zhǎng)的影響

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，在各PDA平板上分別放置一個(gè)無(wú)菌的牛津杯，在距離牛津杯2 cm 處接種竹蓀菌塊（d=6 cm），在牛津杯中加入竹蓀菌拮抗細(xì)菌發(fā)酵液的蛋白粗提液150 μL，以牛津杯中加（NH4）2SO4飽和的5 mmol/L磷酸緩沖溶液作為對(duì)照，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在4℃冰箱中放置12 h 后，24℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照組菌絲長(zhǎng)至平板邊緣時(shí)，測(cè)定抑菌寬度，計(jì)算抑菌率[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹蓀菌拮抗細(xì)菌的鑒定

竹蓀菌拮抗細(xì)菌的菌落形態(tài)為：灰白色，圓形，邊緣不規(guī)則，干燥，有皺褶，不透明，菌落直徑1～2 cm。菌體桿狀，革蘭氏染色反應(yīng)陽(yáng)性。

試驗(yàn)生理生化結(jié)果見(jiàn)表1。查閱伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第八版），表明該菌與巨大芽孢桿菌的生理生化特性的描述完全相同。結(jié)合菌株形態(tài)特征，初步認(rèn)定該菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus magaterium）。

拮抗細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。圖1表明，擴(kuò)增的16S rDNA條帶約為1 500 bp，符合理論預(yù)期值。說(shuō)明該條帶具有高專一性，得率高，能用于直接測(cè)序，并與BLAST進(jìn)行比對(duì)。同源性分析結(jié)果表明，該菌株的16SrDNA 序列與多種Bacillus megaterium的16S rDNA序列相似性高達(dá)99%以上，結(jié)合該菌形態(tài)學(xué)和生理生化特性，鑒定該菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium，Accession AB697153.1）。

2.2 巨大芽孢桿菌對(duì)竹蓀菌絲生長(zhǎng)的影響

圖2表明，巨大芽孢桿菌對(duì)竹蓀菌絲的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，接種了巨大芽孢桿菌的PDA平板上的竹蓀菌絲長(zhǎng)勢(shì)明顯弱于未接種巨大芽孢桿菌的PDA平板，抑制率為58.37%。

2.3 巨大芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)竹蓀菌絲生長(zhǎng)的影響

表2可知，未除菌的巨大芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)竹蓀菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，抑制率為64.81%，過(guò)濾除菌發(fā)酵液、高溫滅菌發(fā)酵液對(duì)竹蓀菌絲的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的抑制作用。

2.4 巨大芽孢桿菌發(fā)酵液蛋白粗提液對(duì)竹蓀菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖3可知，巨大芽孢桿菌發(fā)酵液蛋白粗提液對(duì)竹蓀菌絲的生長(zhǎng)有抑制作用，其抑制率達(dá)到55.9%。

3 討論

具有一定的抑真菌作用為自然土壤的重要功能之一，包含非常復(fù)雜的作用機(jī)制[18]。吳敏娜等[19]認(rèn)為，土壤抑真菌作用與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在密切的關(guān)系。也有學(xué)者認(rèn)為，土壤中存在可直接分泌抗真菌物質(zhì)的微生物，或存在能誘導(dǎo)或促進(jìn)抗真菌微生物產(chǎn)生更多有效物質(zhì)的種群[20-22]。還有研究認(rèn)為，影響土壤抑制真菌的因素之一為土壤細(xì)菌種群多樣性[23]。

已有的研究表明，巨大芽孢桿菌菌株在生物防治方面已發(fā)揮重要作用。曹燕魯?shù)萚17]發(fā)現(xiàn)，Bacillus megaterium B1301對(duì)有害真菌具有拮抗作用。推測(cè)土壤中棲息的某些巨大芽孢桿菌菌株可能與土壤抑真菌作用具有密切關(guān)系。

本文從竹蓀連作地土壤中分離得到一株對(duì)竹蓀菌生長(zhǎng)具有明顯抑制作用的菌株，經(jīng)鑒定為巨大芽孢桿菌。過(guò)濾除菌表明，巨大芽孢桿菌代謝產(chǎn)物中粒徑小于0.22 μm的小分子物質(zhì)對(duì)竹蓀沒(méi)有明顯的抑制作用，未除菌的巨大芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)竹蓀菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，發(fā)酵液蛋白粗提液對(duì)竹蓀菌絲的生長(zhǎng)也具明顯的抑制作用，但對(duì)照液也在一定程度上延緩了竹蓀的生長(zhǎng)，使得竹蓀菌絲橫向上的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，但在縱向上仍能生長(zhǎng)，因此除巨大芽孢桿菌發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌蛋白外，其他抑制竹蓀菌絲生長(zhǎng)的因素還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

有研究表明，竹蓀連作土壤中的微生物區(qū)系、土壤物質(zhì)組成以及酶活力都發(fā)生明顯變化。種植竹蓀初期，新地和連作地細(xì)菌總量、真菌總量差異不大，但生長(zhǎng)至出菇盛期，連作地細(xì)菌總量增幅超過(guò)新地，新地真菌總量增幅遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)連作地，連作使竹蓀菌和土壤真菌都受到抑制，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明土壤物質(zhì)組成變化可能促進(jìn)了土壤巨大芽孢桿菌及其他細(xì)菌的生長(zhǎng)，抑制了竹蓀菌及其他土壤真菌的生長(zhǎng)。巨大芽孢桿菌代謝物的累積，尤其是對(duì)竹蓀生長(zhǎng)具有抑制作用的代謝物蛋白質(zhì)抑制了竹蓀的生長(zhǎng)。其次，竹蓀生長(zhǎng)過(guò)程中，竹蓀菌及其代謝物、土壤微生物及其代謝物共存于種植土壤這個(gè)復(fù)雜的物質(zhì)組成體系，隨著連作年限的增加，導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響竹蓀菌的生長(zhǎng)。這可能都是造成連作障礙現(xiàn)象的原因。

總之，竹蓀連作障礙的形成機(jī)制復(fù)雜，僅從本研究的結(jié)果判定土壤巨大芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白是造成竹蓀連作障礙的主要原因尚不夠充分，下一步工作將應(yīng)用土壤復(fù)雜體系未知物非歧視分析技術(shù)，使用竹蓀生長(zhǎng)趨勢(shì)圖分析技術(shù)，聯(lián)系實(shí)際生產(chǎn)，研究特征代謝物群對(duì)竹蓀菌生長(zhǎng)的影響。

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