豬毛尾線蟲的檢測及其ITS序列分析

郭楠楠，張帆帆，唐玉新,張 敏，吳家斌，吳 瓊，葉 昱*，宋德平*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045；2.江西省畜禽疫病診斷和防控重點實驗室，江西南昌 330045)

毛尾線蟲俗稱鞭蟲，屬于無尾感器綱(Aphasmidea)、毛尾目(Trichurata)、毛尾科(Trichuridae)、毛尾屬(Trichuris)，寄生在人體和動物腸道，可引起人畜共患的寄生蟲病。豬毛尾線蟲(T.suis)又稱豬鞭蟲，寄生于豬盲腸和結(jié)腸內(nèi)，是導(dǎo)致仔豬和育肥豬腹瀉的常見豬寄生蟲。豬毛尾線蟲蟲體呈乳白色，蟲體前段細(xì)長，呈絲狀，后部粗短；是一種具有直接型生活史的蠕蟲，在流行病學(xué)上被稱為土源性蠕蟲，可在土壤中存活5年，且感染能力較強(qiáng)[1]。哺乳及保育、育肥豬等易感，主要是通過食入被感染性蟲卵污染的飲水或者飼料而感染。被食入的感染性蟲卵到達(dá)小腸后，幼蟲從蟲卵中逸出，進(jìn)入小腸絨毛，經(jīng)過一段時間的發(fā)育后逐漸移行至盲腸和結(jié)腸內(nèi)，且可在腸系膜上固著并發(fā)育為成蟲。仔豬和育肥豬感染后主要表現(xiàn)為間歇性或頑固性腹瀉，糞便中可見黏液或血液；隨著病程發(fā)展，豬只食欲不振、被毛粗亂、消瘦，進(jìn)而引起死亡或其他疾病，如鏈球菌病、支原體肺炎等。該病發(fā)病率可達(dá)20%～60%，傳播迅速，死亡率較高，而且偶爾也會感染人[2]，是危害豬群和人類的重要公共衛(wèi)生疾病。病豬主要在腸道、肝臟和肺臟等部位發(fā)生病理變化，表現(xiàn)為盲腸和結(jié)腸內(nèi)充滿蟲體，腸系膜膠凍樣，肝臟出現(xiàn)灰白色寄生蟲結(jié)節(jié)包囊[2]。目前對該病的診斷方法主要有蟲體、蟲卵觀察法和分子生物學(xué)診斷方法等，前者主要通過形態(tài)學(xué)比較進(jìn)行診斷，但是對形態(tài)相近的蟲體、蟲卵以及幼蟲，形態(tài)學(xué)鑒定具有一定的局限性[3]；后者可在分子水平上進(jìn)行診斷，通過擴(kuò)增種內(nèi)高度保守性的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列[4]并與數(shù)據(jù)庫比對，可實現(xiàn)對該蟲的快速檢測。

2015年11月，江西某豬場3月齡～5月齡育肥豬出現(xiàn)頑固性腹瀉，且腹瀉糞便可見黏液，有約10%的豬只出現(xiàn)便血；隨后發(fā)病豬只出現(xiàn)消瘦、蒼白、精神不振等癥狀，大約5%的發(fā)病豬只死亡。通過對典型發(fā)病死亡病例的剖檢，發(fā)現(xiàn)盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物惡臭，且腸道內(nèi)存在大量乳白色的線狀蟲體；利用飽和鹽水漂浮法從腸道內(nèi)容物中檢出大量該蟲蟲卵，結(jié)合成蟲與蟲卵的形態(tài)，初步判斷該線蟲為豬毛尾線蟲。為了對分離的線蟲進(jìn)行進(jìn)一步的種屬鑒定，本研究通過針對寄生蟲ITS序列的通用引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增ITS片段并測序，鑒定該線蟲的種類，為進(jìn)一步開展分子遺傳學(xué)和診斷研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 將江西某豬場發(fā)病育肥豬部分腸道收集后分裝并分別置于4℃和-20℃保存，蟲體從發(fā)病豬腸道內(nèi)分離，并用福爾馬林溶液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 蛋白酶K、10×buffer、dNTP Mixture、DNA聚合酶(rTaq)、DNA Marker DL-2000、pMD18-T載體、DNA膠回收試劑盒等為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；TOP 10感受態(tài)細(xì)胞為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 顯微鏡檢查 挑取約1 g腸道內(nèi)容物于裝有少量飽和氯化鈉溶液的100 mL錐形瓶中，攪拌均勻，續(xù)加飽和氯化鈉溶液至瓶口形成凸面，靜置15 min，載玻片中央觸及凸面迅速翻轉(zhuǎn)，置顯微鏡(100×)下觀察蟲卵并拍照。

1.2.2 蟲體DNA的提取 參照萬新龍[5]、何旭鋒[6]和付美英[7]等對不同線蟲DNA的提取，進(jìn)行蟲體DNA的抽提。具體方法如下：挑取1～2條供試蟲體放入200 μL的EP管中，向EP管中加入16 μL ddH2O和2 μL 10×buffer，置于-80℃ 4 h；從-80℃取出EP管放入85℃水浴鍋中溫浴2 min，取出后加入2 μL 蛋白酶K，56℃水浴保溫3 h，95℃條件下將蛋白酶K滅活10 min，最后將EP管放入離心機(jī)10 000 r/min離心2 min，取上清；將提取的蟲體DNA置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增 該引物參考彭仕明等[8]針對線蟲ITS基因的保守序列設(shè)計，其核苷酸序列組成如下：上游引物為：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′，下游引物為：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2.5 μL DNA模板，1 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，2.5 μL10×PCR buffer，1 μL上游引物(10 μmol/L)，1 μL下游引物(10 μmol/L)，0.3 μL rTaq(5U/μL)，加入ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，36個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳，并通過凝膠成像系統(tǒng)拍攝記錄結(jié)果。

1.2.4 擴(kuò)增片段的克隆、篩選及測序 在紫外燈下將目的條帶切下，用DNA膠回收試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化之后將其與pMD18-T載體4℃過夜連接，后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)入TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，在LB平板(Amp+)涂板過夜培養(yǎng)，挑取單一菌落搖菌擴(kuò)增后進(jìn)行菌液PCR檢測，篩選陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 豬毛尾線蟲ITS核苷酸同源性及進(jìn)化樹分析 將測序結(jié)果錄入NCBI進(jìn)行比對，根據(jù)BLAST結(jié)果初步判斷其種類。參照GenBank中的18條毛尾線蟲ITS基因序列，利用DNAStar 7.10和MEGA 6.0軟件進(jìn)行分析核苷酸序列的同源性，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 蟲卵檢查結(jié)果

利用飽和氯化鈉漂浮法，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到新鮮蟲卵呈棕黃色，形似腰鼓，兩端有塞，且卵殼較厚，大小約為(52～61)μm×(27～30)μm(圖1)。根據(jù)蟲卵形態(tài)初步確定為豬毛尾線蟲卵。

圖1 豬毛尾線蟲卵(100×)

2.2 蟲體ITS序列擴(kuò)增與測序

提取的蟲體DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，可見一條約1 345 bp的特異性片段(圖2)。序列測定結(jié)果與GenBank中登錄的序列進(jìn)行Blast比對，發(fā)現(xiàn)該序列與豬毛尾線蟲參考序列的同源性高達(dá)99.8%，進(jìn)一步確定該線蟲為豬毛尾線蟲。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.PCR產(chǎn)物; 2.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR product; 2.Negative control

圖2豬毛尾線蟲DNA ITS片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 PCR results of ITS gene ofTrichurissuis

2.3 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

將測序所得序列與GenBank中的18條毛尾線蟲序列進(jìn)行比較，核苷酸同源性分析表明分離蟲體的ITS序列與豬毛尾線蟲的核苷酸同源性高達(dá)99.8%，從遺傳學(xué)角度確定其為豬毛尾線蟲。進(jìn)化樹分析表明，本研究分離的江西地區(qū)的豬毛尾線蟲與湖南益陽分離的毛尾線蟲(AM993005)親緣關(guān)系最近，與廣東湛江3型、湖南長沙2型和廣東江陽地區(qū)的豬毛尾線蟲ITS區(qū)存在一定的種內(nèi)差異，但是核苷酸同源性仍>93.5%(圖3)。

“▲”表示本試驗測序線蟲“▲” indicates the isolate sequenced in the study

3 討論

隨著生物種群的不斷進(jìn)化，對一些相似種或近緣種的鑒定單純靠寄生蟲的形態(tài)學(xué)越來越困難，亟需新技術(shù)的引入和運用。近年來，寄生蟲分子分類學(xué)、分子鑒定和分子遺傳學(xué)等技術(shù)在寄生蟲種(株)鑒定方面取得了很大的進(jìn)展，如以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)及單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析等[9]。由于核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列位于18S和28S之間，在生物進(jìn)化過程中顯示種的特性，在種內(nèi)具有高度保守性，在不同種間又有不同程度的變異，故被作為遺傳標(biāo)記廣泛用于寄生線蟲種類鑒定與分類工作[10]，尤其是種間分類研究[11]。本研究根據(jù)病豬體內(nèi)分離蟲體及蟲卵的形態(tài)對發(fā)病豬進(jìn)行初步診斷，而后對分離蟲體的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)擴(kuò)增并測序以及BLAST比對，進(jìn)一步從分子水平上確認(rèn)分離的寄生蟲為豬毛尾線蟲。將測定的ITS序列與18條參考序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)其核苷酸同源性高達(dá)99.8%，與湖南益陽地區(qū)的豬毛尾線蟲親緣關(guān)系最近，與其他地區(qū)的豬毛尾線蟲ITS存在一定的種內(nèi)差異，為進(jìn)一步研究豬毛尾線蟲的分類鑒定、遺傳變異以及其他相關(guān)方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

豬毛尾線蟲是一種常見寄生蟲，可引起豬毛尾線蟲病，感染強(qiáng)度較高，四季均可發(fā)生[12]，且夏季發(fā)病率相對較高[1]，可通過水、食物或者土壤等途徑傳播，發(fā)病豬主要表現(xiàn)為貧血、腹瀉以及漸進(jìn)性消瘦等臨床癥狀，且多發(fā)于保育階段，育肥階段存在散發(fā)現(xiàn)象[13]。少量毛尾線蟲寄生不會引起明顯的臨床癥狀，但感染豬體內(nèi)若有大量蟲體寄生時則會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，嚴(yán)重者引起死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的損失。羥嘧啶是治療毛尾線蟲的特效藥，本病例確診后立即用羥嘧啶進(jìn)行了全面投藥，治療效果確切。豬毛尾線蟲卵具有非常強(qiáng)的抵抗力，成蟲的藥物耐受性較高，通過一次用藥并不能徹底清除蟲體和蟲卵，需要結(jié)合驅(qū)蟲和改善環(huán)境衛(wèi)生等綜合性措施控制本病。因此，每年定期對豬群驅(qū)蟲是必要措施，通常種豬每年驅(qū)蟲3次～4次，商品豬驅(qū)蟲2次～3次；在做好驅(qū)蟲的基礎(chǔ)上，采取改善養(yǎng)殖場及周邊的環(huán)境衛(wèi)生、定期消毒等預(yù)防措施的實施，可以較大程度上減少豬毛尾線蟲病的發(fā)生。

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