利用體外發(fā)酵技術(shù)研究錫林郭勒草原不同生長期牧草瘤胃內(nèi)甲烷產(chǎn)生規(guī)律

賈炳玉，李 超，高 民

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

全球變暖是當(dāng)前公眾關(guān)注的熱點(diǎn)問題。其中，自然界循環(huán)以及人類活動所產(chǎn)生和排放的溫室氣體(greenhouse gas，GHG)是全球變暖的重要因素。當(dāng)大氣層中有大量的溫室氣體聚集時，會對大氣層的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用，從而導(dǎo)致輻射到地球表面的太陽光范圍和強(qiáng)度增加，最終使得全球的氣溫升高。

甲烷(CH4)是僅次于二氧化碳(CO2)的第二大溫室氣體，它對全球溫室效應(yīng)的貢獻(xiàn)率為15%～20%[1]。研究表明，盡管甲烷的排放量還遠(yuǎn)低于CO2，但其致溫室效應(yīng)的潛能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CO2(為23倍～25倍)[2]，另外，由于甲烷具有能長時間存在于大氣層之中(約12年)的特點(diǎn)，因此與單位排量CO2相比，其致溫室效應(yīng)貢獻(xiàn)率更高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的甲烷排放占全球大氣層總甲烷排放的52%[3]，而其中畜牧業(yè)特別是反芻動物養(yǎng)殖業(yè)排放又占絕大多數(shù)。在家畜的甲烷排放量中,反芻動物占97%[4]。2010年，我國反芻家畜甲烷排放量為6.60Tg[5](1Tg=1012g)。因此，甲烷氣體的排放是對大氣和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重威脅，其減排排放對減緩溫室效應(yīng)具有重要意義。甲烷也是重要的能量載體物質(zhì)，其減排對提高營養(yǎng)物質(zhì)能量利用效率，進(jìn)而改善飼料營養(yǎng)成分利用效率，提高動物生產(chǎn)性能具有重要意義。降低CH4的排放能夠提高能量的利用效果，根據(jù)鄧代君等[6]，草原上生長的某些天然植物，例如單寧類植物、皂苷類植物和蔥屬植物等，可以作為天然甲烷菌抑制劑，減少放牧反芻家畜的CH4排放。另外，抑制CH4排放不單單對溫室效應(yīng)的抑制有作用，也有利于家畜對牧草利用率的提高。隨著我國的高速發(fā)展，環(huán)境問題發(fā)展中面對的一個大問題，草原植被的保護(hù)與恢復(fù)重建、退耕還草、草地承載力與家畜配置等項(xiàng)目也是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)，找到一個草原放牧與環(huán)境保護(hù)的平衡點(diǎn)，對于低碳型畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。目前國外牧草體外發(fā)酵研究較多，如Scehovie[7]以天然牧場各種牧草的浸提液與瘤胃液在體外瘤胃模擬裝置中進(jìn)行培養(yǎng)，以產(chǎn)氣量作為指標(biāo)，研究了不同植物種類對瘤胃微生物種群活性的影響。近幾年國內(nèi)也有相關(guān)研究報道，郭彥軍等[8]利用體外產(chǎn)氣法測定高山牧草和灌木的干物質(zhì)降解率，發(fā)現(xiàn)12 h的產(chǎn)氣量與48 h的干物質(zhì)降解率之間呈正相關(guān)關(guān)系，產(chǎn)氣量與縮合單寧含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

本試驗(yàn)以錫林郭勒盟毛登牧場為例，通過采集牧草進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)測定其瘤胃內(nèi)甲烷產(chǎn)量，為準(zhǔn)確估測放牧綿羊CH4排放提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 牧草樣品的采集 2016年7、8、9三個月份采集錫盟毛登牧場的牧草，每個月采集一次牧草，每次采集10個1 m2的樣方，樣方在一條直線上，間隔20 m。采集后帶回實(shí)驗(yàn)室105 ℃烘干，粉碎，得到混合牧草樣品。四種優(yōu)勢品種牧草(羊草、隱子草、苔草、針茅)分別采集1 kg，帶回實(shí)驗(yàn)室105 ℃烘干，粉碎，得到單一牧草樣品。

1.1.2 人工瘤胃培養(yǎng)液的制備 選擇2只健康、體重(25.0±2.0)kg 的成年湘東黑山羊，安裝永久性瘤胃瘺管，作為瘤胃液供體動物，單籠飼養(yǎng)。飼糧精粗比為40:60，精飼料組成為玉米47.00%，豆粕24.00%，麥麩22.00%，食鹽0.77%，石粉2.23%，預(yù)混料4.00%。粗飼料為玉米秸稈，整個試驗(yàn)期內(nèi)，每只瘺管羊每天飼喂精飼料200 g，粗飼料300 g，自由飲水。每天08:30和18:00分2次等量飼喂。晨飼前1 h通過瘺管采集新鮮瘤胃液，迅速裝入保溫瓶帶回實(shí)驗(yàn)室。參照Menke等[9]的瘤胃營養(yǎng)液的配制方法，配制2 400 mL瘤胃營養(yǎng)液，備用。將采集到的瘤胃液迅速用6層脫脂紗布準(zhǔn)確過濾出600 mL，加入到提前準(zhǔn)備好的2 400 mL營養(yǎng)液中，配制成混合人工瘤胃培養(yǎng)液，利用磁力攪拌儀攪拌均勻，整個過程保持39.5 ℃進(jìn)行并始終通入CO2以保持厭氧環(huán)境。

1.1.3 體外模擬瘤胃發(fā)酵設(shè)備 本試驗(yàn)采用全自動體外模擬瘤胃發(fā)酵設(shè)備[10]。該設(shè)備包括恒溫培養(yǎng)箱、厭氧發(fā)酵瓶、壓力傳感器、三通電磁閥、計(jì)算機(jī)和安捷倫氣相色譜儀。培養(yǎng)箱設(shè)定振蕩頻率為50 r/min，培養(yǎng)溫度為39.5 ℃；厭氧瓶放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)部，通過膠皮導(dǎo)管與壓力傳感器和三通電磁閥相連接。發(fā)酵開始后，可實(shí)時記錄厭氧發(fā)酵瓶中的壓力，并通過壓力與氣體體積間的關(guān)系計(jì)算厭氧發(fā)酵瓶中的氣體生成量。當(dāng)厭氧發(fā)酵瓶中的壓力超過9 kPa時，計(jì)算機(jī)控制三通電磁閥打開，厭氧發(fā)酵瓶中的氣體被釋放，氣體通過氣體導(dǎo)管進(jìn)入氣相色譜儀(安捷倫7890A，美國)，測定氫氣(甲烷)產(chǎn)量根據(jù)厭氧瓶頂部空間大小、壓力與氣體體積的轉(zhuǎn)化系數(shù)和氫氣(甲烷)含量進(jìn)行計(jì)算[11]。

1.2 試驗(yàn)方法

將牧草按照不同種類分為五組，一種混合牧草，四種單一優(yōu)勢牧草，烘干，粉碎。每個組1個平行，重復(fù)3次。稱取0.6 g底物加入到145 mL的厭氧發(fā)酵瓶中，置于39.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱，抽取60 mL配制好的人工瘤胃培養(yǎng)液加入發(fā)酵瓶中，加入培養(yǎng)液的同時向厭氧發(fā)酵瓶中通入CO2以保證發(fā)酵瓶中為厭氧環(huán)境，將發(fā)酵瓶放入體外發(fā)酵設(shè)備，連接壓力傳感器，體外發(fā)酵開始。

1.2.1 體外發(fā)酵指標(biāo)的測定

1.2.1.1 干物質(zhì)消失率的測定 進(jìn)行體外發(fā)酵48 h，終止后，采用Tilley等[12]的方法計(jì)算干物質(zhì)消失率。

1.2.1.2 VFA的測定 揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的濃度測定，參照秦為琳[13]的方法。在48 h體外發(fā)酵終止后，取發(fā)酵液2 mL，15 000 rpm、4 ℃條件下離心8 min(德國Eppendorf公司)，吸取上清液1.5 mL，加入0.15 mL、25%的偏磷酸溶液固定VFA，靜置15 min后利用氣相色譜儀(安捷倫7890A)測定VFA含量和組成。

1.2.1.3 甲烷含量和甲烷產(chǎn)量的測定 甲烷含量可直接通過氣相色譜儀測定。甲烷產(chǎn)量根據(jù)甲烷含量、厭氧發(fā)酵瓶頂部空間大小和壓力進(jìn)行計(jì)算[11]。

應(yīng)用非線性軟件程序(NLREG)，按照Wang[14]提出的模型對體外發(fā)酵產(chǎn)氣曲線進(jìn)行擬合。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用Excel初步記錄并做簡單處理，然后用SPSS 21軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用一般線性模型(GLM)程序和Duncan氏法多重比較，使用正交多項(xiàng)比較(orthogonal polynomial contrast)分析各個指標(biāo)變化的趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 牧草產(chǎn)氣量

當(dāng)48 h體外發(fā)酵停止后得到三個月(7、8、9)產(chǎn)氣量數(shù)據(jù)，產(chǎn)氣量連續(xù)記錄48 h，每間隔1 h計(jì)算累積產(chǎn)氣量。從表1可知，不同生長期牧草體外發(fā)酵產(chǎn)氣量隨發(fā)酵時間延長逐漸增加，在前期迅速增加，36 h后增長速率變慢，最后趨于平緩。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是在后期培養(yǎng)過程中，代謝產(chǎn)物累積導(dǎo)致發(fā)酵瓶中的pH下降，抑制瘤胃微生物發(fā)酵或者微生物大量死亡，使得剩余的底物發(fā)酵不完全[15]。也有可能是因?yàn)榘l(fā)酵時間接近結(jié)束，能夠發(fā)酵的底物減少導(dǎo)致。相同月份的不同品種牧草間比較，羊草的產(chǎn)氣量高于其他牧草，針茅的產(chǎn)氣量比較少。不同月份的同一品種牧草比較，隨著月份增加，產(chǎn)氣量下降。

表1 不同生長期牧草體外發(fā)酵產(chǎn)氣量Table 1 In vitro fermentation of herbage in different growth stages

2.2 甲烷產(chǎn)量

由表2可見， 8、9兩個月份甲烷產(chǎn)量與7月份相比，下降差異顯著(P<0.05)。9月份氫氣產(chǎn)量與7、8月份相比產(chǎn)量增多，有顯著差異。從氫的代謝角度講，產(chǎn)氫微生物是瘤胃中氫的主要生成者。牧草(纖維類植物)的降解是產(chǎn)生氫的重要途徑，纖維分解菌在瘤胃生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮中樞作用，大多數(shù)纖維分解菌的主要代謝終產(chǎn)物為氫。

甲烷生成的抑制會引起氫的積累，抑制細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)氧化還原過程中輔酶的再氧化，最終抑制纖維降解 。產(chǎn)甲烷菌是主要耗氫微生物，利用瘤胃內(nèi)其他微生物產(chǎn)生的發(fā)酵終產(chǎn)物，尤其是氫作為底物產(chǎn)生甲烷，甲烷菌被抑制后往往會出現(xiàn)氫的累積[16]。從表2和表3中看出，隨著時間推移甲烷產(chǎn)量降低，氫的產(chǎn)量增加，結(jié)論與上述研究相符。隨著月份增加，牧草的甲烷產(chǎn)量都呈現(xiàn)下降趨勢。氫氣產(chǎn)量呈現(xiàn)上升趨勢，和前面所得到的結(jié)果一直，符合甲烷產(chǎn)量降低，氫的產(chǎn)量增加的趨勢。

2.3 干物質(zhì)消失率

干物質(zhì)消失率(IVDMD)是體外發(fā)酵技術(shù)評定日糧底物被瘤胃微生物消化利用程度的最基礎(chǔ)指標(biāo)。劉樹軍[17]對不同飼草的體外發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)，不同牧草發(fā)酵程度不同，雖然玉米青貯和國產(chǎn)苜蓿干草的IVDMD差異不顯著，但兩者IVDMD顯著高于其他牧草。本試驗(yàn)中，48 h體外發(fā)酵終止后，計(jì)算出干物質(zhì)消失率。其中羊草的平均干物質(zhì)消失率最高，針茅的平均干物質(zhì)消失率最低。從圖1中可看出，7月干物質(zhì)消失率明顯高于8、9兩個月，說明7月底物更容易被瘤胃微生物降解，隨著牧草的生長成熟，纖維化程度越來越高，品質(zhì)下降，干物質(zhì)消失率呈現(xiàn)下降趨勢。同時表明干物質(zhì)消失率高，甲烷產(chǎn)量也隨之升高。

表2 不同月份混合牧草體外瘤胃發(fā)酵甲烷、氫氣含量及產(chǎn)量Table 2 The methane, hydrogen content and yield of mixed pasture in different months in vitro

表3 優(yōu)勢品種牧草類生長月份甲烷、氫氣產(chǎn)量Table 3 The methane, hydrogen content and yield of dominant species forage in growing month

2.4 揮發(fā)性脂肪酸的測定

揮發(fā)性脂肪酸(VFA)中的乙酸、丙酸和丁酸對動物體代謝作用最為重要，大約占瘤胃總VFA產(chǎn)量的95%[18]。可為動物提供能量，同時也是合成體脂肪和乳脂肪的原料。由表4可見，隨著月份增加，混合牧草的乙酸產(chǎn)量、丙酸產(chǎn)量和乙酸/丙酸比值都呈現(xiàn)下降趨勢，特別是9月和7月相比，差異顯著(P<0.05)。這一結(jié)果與韓繼福等[19]的研究相符合，CH4產(chǎn)量與乙酸產(chǎn)量、丙酸產(chǎn)量、和乙酸/丙酸比值均呈正相關(guān)。由表5可見,單一牧草的乙酸產(chǎn)量、丙酸產(chǎn)量和乙酸/丙酸比值變化情況，得出隨著月份增加，牧草中羊草、針茅乙酸產(chǎn)量、丙酸產(chǎn)量和乙酸/丙酸比值下降明顯，甲烷產(chǎn)量也都隨之下降，符合正常變化規(guī)律。苔草、隱子草則相反，隨著生長時間加長，乙酸產(chǎn)量、丙酸產(chǎn)量和乙酸/丙酸比值反而增加，但是甲烷產(chǎn)量則呈下降變化，原因可能是因?yàn)闅錃獾姆e累，抑制甲烷的生成，符合前文所說的情況。

圖1 不同生長期干物質(zhì)消失率變化Fig.1 Change of dry matter disappearance rate indifferent growing stages

表4 混合牧草產(chǎn)生VFA濃度變化Table 4 VFA concentration variation of mixed pasture

3 小 結(jié)

本試驗(yàn)通過體外發(fā)酵測定錫林郭勒盟毛登牧場牧草(一種混合牧草，四種單一優(yōu)勢牧草)生長期的甲烷、氫氣產(chǎn)量及總產(chǎn)氣量變化，以及揮發(fā)性脂肪酸和干物質(zhì)消失率的變化，發(fā)現(xiàn)：隨著牧草生長期的加長，牧草總產(chǎn)氣量呈現(xiàn)下降趨勢，8、9兩個月甲烷產(chǎn)量較7月下降且差異顯著(P<0.05)，9月份氫氣產(chǎn)量與7、8月份相比產(chǎn)量增多；隨著月份的增加，牧草平均干物質(zhì)消失率呈現(xiàn)下降趨勢，其中羊草的平均干物質(zhì)消失率最高，針茅的平均干物質(zhì)消失率最低；并且，隨著月份的增加，牧草中揮發(fā)性脂肪酸乙酸和丙酸以及乙酸/丙酸比值均呈現(xiàn)下降趨勢，與甲烷產(chǎn)量呈正相關(guān)。

表5 優(yōu)勢品種牧草類生長月份總VFA產(chǎn)量變化Table 5 Variation of total VFA yield for dominant species of forage species

參考文獻(xiàn)：

[1] DE VISSCHER A,VAN CLEEMPUT O. Simulation model for gas diffusion and methane oxidation in landfill cover soils[J].Waste Management,2003,23(7):581-591.

[2] CLIMATE CHANGE: The Scientific Basis: Contribution of Working Group I to the Third Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change[M].Cambridge University Press,UK,2001.

[3] SMITH P,MARTINO D,CAI Z,et al. Greenhouse gas mitigation in agriculture[J]. Biological Science,2008, 363(1492): 789-813.

[4] 程勝利,肖玉萍,楊保平,等.反芻動物甲烷排放現(xiàn)狀及調(diào)控技術(shù)研究進(jìn)展[J],中國草食動物科學(xué),2013,33(5):56-59.

[5] 王榮,鄧近平,王敏,王玉詩,張玉茹,顏志成,譚支良. 基于IPCC Tier 1層級的中國反芻家畜胃腸道甲烷排放格局變化分析[J]. 生態(tài)學(xué)報,2015,35(21):7 244-7 254.

[6] 鄧代君,王金合,杜晉平,等. 植物提取物對瘤胃發(fā)酵的調(diào)控作用[J]. 飼料工業(yè),2009,30(8):5-6.

[7] SCEHOVIC J. In vitro measurement of rumen microbial activity in the presence of extracts from natural grassland spieces[J].Forages,1998,154:249-260.

[8] 郭彥軍,龍瑞軍,張德罡,等. 利用體外產(chǎn)氣法測定高山牧草和灌木的干物質(zhì)降解率[J]. 草業(yè)學(xué)報,2003,12(2):54-60.

[9] MENKE K H,RAAB L,SALEWSKI A,et al. The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feeding stuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro[J]. The Journal of Agricultural Science，1979, 93(1):217-222.

[10] MUETZEL S,HUNT C L,TAVENDALE M H. Brief communication: evaluating rumen fluid from sheep and cattle as inoculum in a newly developed automated in vitro rumen batch culture system[J]. Proceeding of the New Zealand Society of Animal Production,2011,71:240-242.

[11] WANG M，TANG S X，TAN Z L，et al. A mathematical model to describe in vitro kinetics of H2 gas accumulation[J]. Animal Feed Science and Technology,2013,184:1-16.

[12] TILLEY，J M A，TERRY R A. A two-period technique for the in vitro digestion of forage crops[J]. Grass and Forage Science,1963,18(2):104-111.

[13] 秦為琳. 應(yīng)用氣相色譜測定瘤胃揮發(fā)性脂肪酸方法的研究改進(jìn)[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1982,5(4):110-116.

[14] WANG M，TANG S X，TAN Z L，et al. Modeling in vitro gas production kinetics: Derivation of Logistic-Exponential(LE)equations and comparison of models[J]. Animal Feed Science and Technology,2011,165(3-4):137-150.

[15] 余苗. 不同生長期兩種牧草瘤胃降解率及體外發(fā)酵產(chǎn)氣特性的研究[D].長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[16] 韓如旸,閔航,陳美慈,趙宇華. 嗜熱厭氧纖維素降解細(xì)菌的分離、鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 微生物學(xué)報,2002,42(2):138-144.

[17] 劉樹軍．不同飼草的體外發(fā)酵甲烷產(chǎn)生量研究[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2011.

[18] 李旺.瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的作用及影響因素[J]. 中國畜牧雜志,2012,48(7):63-66.

[19] 韓繼福,馮仰廉,張曉明,等.閹牛不同日糧的纖維消化、瘤胃內(nèi)VFA對甲烷產(chǎn)生量的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,1997,17(3):278-280.