茶葉中多種氨基酸15N同位素豐度的檢測(cè)研究

侯 捷，張鵬帥，侯靜華，雷 雯，杜曉寧

(上?；ぱ芯吭河邢薰?國(guó)家同位素工程技術(shù)研究中心上海分中心上海穩(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心，上海 200062)

茶葉中富含多種氨基酸，是構(gòu)成茶葉品質(zhì)和滋味的重要成分，對(duì)茶葉香氣的形成有著重要的作用[1]。氨基酸在茶葉加工過(guò)程中參與茶葉香氣的形成，由氨基酸所轉(zhuǎn)化成的醇類等揮發(fā)性物質(zhì)都是茶葉的香味物質(zhì)。如茶氨酸可以緩解茶葉的苦澀味增強(qiáng)其甜味，是茶葉品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要因子之一[2-5]，絲氨酸、丙氨酸的甜味，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺具有的鮮甜帶酸滋味特性共同影響了茶葉的品質(zhì)和滋味[6-8]。對(duì)茶葉中具有呈味特性的氨基酸(茶氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸)進(jìn)行含量測(cè)定，可以評(píng)價(jià)茶葉的品質(zhì)級(jí)別[9]。隨著代謝組學(xué)的發(fā)展，通過(guò)穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)可以追蹤目標(biāo)化合物的合成與代謝過(guò)程，進(jìn)而有效地對(duì)目標(biāo)氨基酸的生成過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。如利用13CO2研究茶樹呼吸作用對(duì)茶葉品質(zhì)的影響；通過(guò)對(duì)茶樹施加15N標(biāo)記硝態(tài)氮、15N標(biāo)記銨態(tài)氮等氮肥，檢測(cè)茶樹體對(duì)肥料的轉(zhuǎn)化利用情況，通過(guò)氨基酸在茶樹體內(nèi)的代謝積累，進(jìn)而研究茶樹對(duì)土壤中不同氮素肥料的利用水平[10-11]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)大多是對(duì)不同基質(zhì)中的氨基酸含量進(jìn)行分析[12-18]，而關(guān)于樣品中15N標(biāo)記氨基酸同位素豐度的檢測(cè)方法的報(bào)道較少[19]。本文以茶葉中15N富集氨基酸的同位素豐度檢測(cè)為例，在優(yōu)化的衍生化條件下建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定植物中15N富集氨基酸同位素豐度的檢測(cè)方法，在10%～98%的15N同位素豐度范圍內(nèi)對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)茶葉中六種目標(biāo)氨基酸的同位素豐度進(jìn)行測(cè)定。

1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：GC-MS/MS，7890B-7000C，美國(guó)Agilent公司；HP-5 MS毛細(xì)管柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)Agilent公司；電子天平：精度0.01 mg，美國(guó)OHAUS；真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超聲機(jī)：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；渦旋震蕩機(jī)：上海安譜科技有限公司；氮吹儀：上海安譜科技有限公司；低溫高速離心機(jī)：韓國(guó)Heraeus公司；超純水系統(tǒng)：美國(guó)Merck Millipore 公司。

衍生化試劑N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)：美國(guó)Regis Technologies公司；天然豐度氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：茶氨酸(純度98.5%)、丙氨酸(純度99.0%)、天門冬酰胺(純度98.5%)、谷氨酸(純度99.2%)、谷氨酰胺(純度98.5%)、絲氨酸(純度99.0%)：購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；穩(wěn)定同位素15N標(biāo)記高豐度氨基酸對(duì)照品：丙氨酸-15N(純度98.5%，豐度98.5%)、天門冬酰胺-15N2(純度98.2%，豐度98.1%)、谷氨酸-15N(純度98.8%，豐度98.2%)、谷氨酰胺-15N2(純度98.6%，豐度98.8%)、絲氨酸-15N(純度98.1%，豐度95.5%)：上?；ぱ芯吭河邢薰痉€(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心研制，同位素豐度由氣體同位素質(zhì)譜儀(Finnigan MAT-271)測(cè)定；綠茶樣品：中科院茶葉研究所(杭州)提供；乙腈(色譜級(jí))：西班牙Scharlab公司；甲苯(分析純)、吡啶(分析純)：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 氨基酸對(duì)照品的配制

天然豐度氨基酸對(duì)照品：稱取谷氨酸10.3 mg，谷氨酰胺10.3 mg，天冬酰胺9.7 mg，丙氨酸10.2 mg，絲氨酸9.0 mg，茶氨酸9.1 mg，每種氨基酸均溶于水并定容至10 mL容量瓶中，作為天然豐度氨基酸對(duì)照品待用，除15N標(biāo)記的茶氨酸外，其余5種15N標(biāo)記的氨基酸稱取相同的質(zhì)量，均溶于水并定容至10 mL容量瓶中，作為15N標(biāo)記高豐度氨基酸對(duì)照品待用。將天然豐度氨基酸對(duì)照品與15N標(biāo)記高豐度氨基酸對(duì)照品按照9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、2∶8的比例制成不同豐度的氨基酸對(duì)照品。取上述對(duì)照品及純15N標(biāo)記高豐度氨基酸溶液各50 μL于氣相瓶中，氮吹干，依次加入200 μL吡啶和200 μL MSTFA，80 ℃下反應(yīng)60 min，待GC-MS分析。

2.2 茶葉樣品的處理

稱取粉碎后的茶葉樣品0.251 1 g，加入5 mL煮沸的蒸餾水，水浴加熱10 min，待冷卻后，轉(zhuǎn)入25 mL離心管中，以10 000 r/min的速率離心15 min，上清液氮吹干后，40 ℃真空干燥2 h，依次加入500 μL吡啶和500 μL MSTFA，80 ℃下反應(yīng)60 min，待GC-MS分析。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件

2.3.1色譜條件 色譜柱：Agilent HP-5 MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He(純度99.999%)，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度290 ℃；升溫程序：以5 ℃/min由80 ℃升至110 ℃，然后以10 ℃/min升至150 ℃，以5 ℃/min升至170 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，最后以20 ℃/min升至300 ℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1。

2.3.2質(zhì)譜分析條件 電子轟擊離子源(EI)，電離能量70 eV；全掃描(Scan)模式，掃描范圍m/z50～500；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度300 ℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 氨基酸衍生化方法優(yōu)化

3.1.1衍生化試劑 有報(bào)道以MSTBFA[20]或MDBSTFA[21]為衍生化試劑，研究了大腸桿菌、酵母等微生物中或菌體內(nèi)13C標(biāo)記氨基酸同位素豐度。對(duì)比了BFTFA(N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺)和MSTFA(N-甲基-N(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺)對(duì)目標(biāo)氨基酸的衍生化效果。在硅烷化反應(yīng)進(jìn)程中，三甲基硅烷(TMS)將取代氨基酸中含有活性氫的基團(tuán)(羧基上的H和氨基上的H)，如圖1所示。與BSFTA相比，MSTFA對(duì)目標(biāo)氨基酸的衍生化效率更高。

圖1 丙氨酸與MSTFA的反應(yīng)Fig.1 Derivatization reaction of alanine with MSTFA

輔助有機(jī)溶劑對(duì)衍生化效果也有一定影響，輔助溶劑是待測(cè)物中某些物質(zhì)的配體，會(huì)影響衍生化反應(yīng)的速率。比較乙腈、吡啶、甲苯作為輔助溶劑對(duì)目標(biāo)氨基酸衍生化效果的影響，結(jié)果示于圖2。從單種氨基酸分別以乙腈、吡啶、甲苯作為輔助衍生化試劑的比較可見，甲苯和吡啶作為溶劑的衍生化效果較好，然而吡啶對(duì)于天冬酰胺的衍生化效率很低，綜合考慮，選用甲苯作為輔助衍生試劑。

圖2 輔助溶劑對(duì)目標(biāo)氨基酸衍生化效率的影響Fig.2 Effect of solvent on derivatization

3.1.2衍生化溫度及時(shí)間 衍生化的溫度及時(shí)間也是影響衍生化效率的因素。以甲苯作為輔助溶劑，對(duì)比了茶氨酸在60、70、80、90 ℃分別衍生20、40、60 min時(shí)的效果，隨著溫度升高、衍生化時(shí)間的增加，茶氨酸的衍生化效率提高，結(jié)果示于圖3。綜合考慮，確定衍生化溫度為80 ℃，衍生時(shí)間為60 min。

3.2 氨基酸對(duì)照品的檢測(cè)

3.2.1天然豐度氨基酸與15N標(biāo)記氨基酸的GC-MS圖譜分析 將衍生化的氨基酸對(duì)照品進(jìn)行GC-MS分析，改變氣相色譜的升溫程序，茶氨酸和谷氨酰胺始終沒(méi)有達(dá)到基線分離，本文主要對(duì)氨基酸的同位素豐度進(jìn)行分析，茶氨酸和谷氨酰胺沒(méi)有基線分離并不會(huì)對(duì)同位素豐度計(jì)算產(chǎn)生影響。將氨基酸衍生物的離子碎片信息在NIST譜庫(kù)中進(jìn)行匹配，6種天然豐度氨基酸衍生物的出峰順序?yàn)椋罕彼?、絲氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、茶氨酸、谷氨酰胺。天然豐度氨基酸對(duì)照品和15N標(biāo)記氨基酸對(duì)照品衍生物的GC-MS總離子流圖示于圖4。

圖3 衍生溫度及時(shí)間對(duì)目標(biāo)氨基酸衍生化效率的影響Fig.3 Effect of temperature on derivatization

1——丙氨酸；2——絲氨酸；3——谷氨酸；4——天冬酰胺；5——茶氨酸；6——谷氨酰胺 圖4 天然豐度氨基酸對(duì)照品(a)和15N標(biāo)記氨基酸對(duì)照品(b)衍生物的GC-MS總離子流圖1——Alanine；2——Serine；3——Glutamic acid；4——Asparagine；5——Theanine；6——GlutamineFig.4 Total ion chromatograms of natural abundance (a) and high abundance 15N labeling (b) reference substance derivatives

根據(jù)氨基酸衍生物的出峰時(shí)間以及離子碎片信息，對(duì)15N標(biāo)記的氨基酸衍生物進(jìn)行定性分析。以谷氨酸為例，天然豐度的谷氨酸出峰時(shí)間為15.5 min，基峰為m/z246，EI質(zhì)譜圖如圖5a所示；15N標(biāo)記亮氨酸的出峰時(shí)間與天然豐度相同，且只有1個(gè)N被15N取代，其基峰為m/z247，如圖5b所示。

天然豐度氨基酸和15N標(biāo)記氨基酸具有相同的色譜行為，出峰時(shí)間相同。由于氨基酸中的N被15N取代個(gè)數(shù)的不同，從而具有不同的特征離子碎片，結(jié)果列于表1。

3.2.2不同15N豐度氨基酸的檢測(cè)方法精密度和準(zhǔn)確度的驗(yàn)證 茶葉中氨基酸的合成以及代謝是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程，受多種環(huán)境條件的影響，實(shí)際樣品中目標(biāo)氨基酸的同位素豐度分布范圍較大。為了驗(yàn)證在不同同位素豐度水平下所建立方法的準(zhǔn)確度，利用不同比例的天然豐度氨基酸和高豐度氨基酸配制了15N同位素豐度為10%、20%、30%、50%、80%、98%的樣品對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證(配制方法見2.1)，檢測(cè)結(jié)果列于表2。

圖5 天然豐度谷氨酸(a)和15N標(biāo)記谷氨酸(b)EI圖譜(※：標(biāo)記位置)Fig.5 Electron impact (EI) spectra of natural glutamic acid (a) and high abundance 15N labeling glutamic acid (b) (※: labeling site)

氨基酸分子式保留時(shí)間/min特征離子碎片m/z15N標(biāo)記個(gè)數(shù)包含標(biāo)記位點(diǎn)特征離子碎片m/z丙氨酸絲氨酸谷氨酸天冬酰胺茶氨酸谷氨酰胺C3H7NO2C3H7NO3C5H9NO4C4H8N2O3C7H14N2O3C5H10N2O36.811.315.816.017.517.9116204246188273245111122117205247189275247

表2 不同豐度的丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺測(cè)定結(jié)果的驗(yàn)證Table 2 Isotope abundance of 15N labeling amino acids

續(xù)表2

注：同位素豐度：1) 10%15N；2) 20%15N；3) 30%15N；4) 40%15N；5) 80%15N；6) 98%15N。

由表2可見，連續(xù)3次進(jìn)樣并計(jì)算同位素豐度，其精密度RSD小于0.6%。同位素豐度計(jì)算值與理論值基本相符，絕對(duì)偏差小于0.6%，說(shuō)明方法在不同同位素豐度水平下均具有較好的準(zhǔn)確度，同位素豐度計(jì)算方法可以滿足測(cè)定需求。

3.3 茶葉6種15N標(biāo)記氨基酸的檢測(cè)

將茶葉樣品中的氨基酸進(jìn)行提取和衍生化處理后，使用建立的方法進(jìn)行分析，GC-MS離子流圖示于圖6。

1——丙氨酸；2——絲氨酸；3——谷氨酸；4——天冬酰胺；5——茶氨酸；6——谷氨酰胺 圖6 茶葉中氨基酸衍生化離子流圖1——Alanine；2——Serine；3——Glutamic acid；4——Asparagine；5——Theanine；6——GlutamineFig.6 Total ion chromatograms of amino acids derivatives in tea

由圖6中可以識(shí)別60余色譜峰，其中6種目標(biāo)氨基酸均被檢出。目標(biāo)氨基酸的保留時(shí)間與天然豐度對(duì)照品(見圖4a)相互對(duì)應(yīng)，EI圖譜中特征離子與表1一致(如圖7所示)。通過(guò)特征離子質(zhì)量簇[22]，計(jì)算得出6種目標(biāo)氨基酸的同位素豐度值列于表3。

a——丙氨酸；b——絲氨酸；c——谷氨酸；d——天冬酰胺；e——茶氨酸；f——谷氨酰胺 圖7 茶葉中目標(biāo)氨基酸EI圖譜a——Alanine;b——Serine;c——Glutamic acid;d——Asparagine;e——Theanine;f——GlutamineFig.7 Electron impact (EI) spectra of targets in tea

天然氨基酸15N同位素豐度實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組丙氨酸絲氨酸谷氨酸天冬酰胺茶氨酸谷氨酰胺33.9%24.1%39.7%20.6%23.1%25.9%1.2%1.6%1.1%1.2%1.7%1.5%

由表3可以看出，實(shí)驗(yàn)組中6種目標(biāo)氨基酸的同位素豐度均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明茶葉通過(guò)吸收15N標(biāo)記的氮肥，經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化形成了15N標(biāo)記的氨基酸，證實(shí)了相關(guān)代謝通路的存在。

4 結(jié)論

在優(yōu)化的衍生化條件下，建立了氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定茶葉中丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、茶氨酸、谷氨酰胺同位素豐度的檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)不同同位素豐度水平的樣品測(cè)定，驗(yàn)證了方法的同位素檢測(cè)結(jié)果良好，同位素豐度絕對(duì)偏差小于0.6%，方法的精密度優(yōu)于0.6%。通過(guò)對(duì)茶葉實(shí)際樣品中六種氨基酸同位素豐度的測(cè)定可以看出，利用高豐度15N氮肥作為肥料的茶葉樣品其氨基酸的同位素豐度顯著高于對(duì)照組, 根據(jù)對(duì)不同采樣時(shí)間、不同條件下的茶葉中氨基酸同位素豐度的測(cè)定，可以系統(tǒng)地研究茶葉中氨基酸的轉(zhuǎn)化路徑及代謝循環(huán)規(guī)律，為茶葉品質(zhì)的研究提供依據(jù)。所建立的方法也可推廣至其他不同農(nóng)作物中氨基酸同位素豐度的檢測(cè)，為植物中氨基酸相關(guān)轉(zhuǎn)化路徑及代謝循環(huán)研究提供技術(shù)支持。

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