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    大腸桿菌亞型致膿毒癥模型比較研究

    2018-07-04 13:12:20張晶晶孔憲斌霍景瑞王蕾劉穎楊曉暉田毅侯振江陳鋒陳旭義孫世中夏天光孫中磊黃夢強劉英富
    天津醫(yī)藥 2018年6期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)毒素臟器造模

    張晶晶,孔憲斌,霍景瑞,王蕾,劉穎,楊曉暉,田毅,侯振江,陳鋒,陳旭義,孫世中,夏天光,孫中磊,黃夢強,劉英富△

    膿毒癥是具有高死亡率的疾病,嚴重危害人類生命健康[1],同時耗費了大量資金投入[2],但膿毒癥相關(guān)研究發(fā)展相對緩慢[3]。目前,常用的膿毒癥動物模型有盲腸結(jié)扎穿孔模型(cecal ligation and puncture,CLP)、升結(jié)腸支架置入致腹膜炎(colon ascendens stent peritonitis,CASP)、腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)及腹腔注射活菌致膿毒癥模型。然而,現(xiàn)有膿毒癥模型不能完全模仿臨床膿毒癥患者的發(fā)病過程,這也是制約膿毒癥研究進展的重要原因之一[4]。CLP模型和CASP模型常因結(jié)扎盲腸的部位和針頭的尺寸差異造成模型均一性不足[5-6]。LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型是急性內(nèi)毒素血癥模型,不能較好地模擬膿毒癥患者對抗微生物感染過程和免疫應(yīng)答反應(yīng)[7]。腹腔注射大腸桿菌可誘發(fā)致死性腹部感染和膿毒癥,可展現(xiàn)宿主抗菌防御機制的信息[8],且制作方法簡單、方便、均一性較好,但因注射細菌的種類不同,引起膿毒癥損傷程度有所差異。本研究旨在對比分析不同類型的大腸桿菌引起的膿毒癥小鼠的損傷程度,以規(guī)范腹腔注射細菌致膿毒癥的建模方法,為相關(guān)研究提供參考。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 (1)實驗動物。清潔級雄性BALB/c小鼠152只,6~8周齡,體質(zhì)量18~25 g,從中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心獲?。郾本袊鳶CXK-(軍)2012-0004],小鼠被安置在無病原體的環(huán)境中,自由進食飲水,室內(nèi)溫度維持(22±2)℃,人工光暗周期12 h,所有實驗都參照動物倫理規(guī)范。(2)試劑。大腸桿菌 DH5α、CMCC44102、ATCC25922由本實驗室保存;小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司;兔抗小鼠高遷移率族蛋白1(HMGB1)抗體購自Abcam公司,兔抗小鼠β-Tubulin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司,ECL發(fā)光液購自Millipore公司。

    1.2 細菌懸浮液的制備及濃度測定 將細菌接種于100 mL的無菌培養(yǎng)基中,在37℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)12 h,隨后分別在培養(yǎng)基中取1 mL進行10倍梯度稀釋,稀釋到10-9倍。在10-5~10-9稀釋倍數(shù)中各取500 μL倒入裝有無菌瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,并順時針轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿,使菌液充分平鋪,隨后倒置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)12 h的培養(yǎng)皿取出,計平板的細菌菌落數(shù),推算原液細菌濃度,以原液中每毫升集落形成單位(clonal formation unit/Milliliter,CFU/mL)表示。

    1.3 動物分組及處理 用隨機數(shù)字表法將152只小鼠分為對照組、DH5α組、44102組和25922組,每組38只。DH5α組、44102組、25922組分別腹腔注射300 μL濃度為1.0×109CFU/kg的大腸桿菌DH5α、44102、25922;對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。3組細菌膿毒癥模型均出現(xiàn)食欲不振,自潔能力下降,毛發(fā)失去光澤,獨處,瞇眼,分泌物增多等膿毒癥造模成功的表現(xiàn),對照組無上述表現(xiàn),飲食如常。共造模152只,0只死亡,最后入組152只,各組38只。

    1.4 血細菌培養(yǎng) 取造模成功后小鼠16只,每組4只[9],造模8 h后,各組經(jīng)眼眶靜脈叢無菌取血,肝素抗凝,各血液標本經(jīng)LB液體培養(yǎng)基10倍稀釋后分別取0.1 mL均勻涂布于LB固體平板,37℃孵育18 h,菌落計數(shù)儀統(tǒng)計菌落數(shù)并拍照,根據(jù)稀釋濃度最終換算到血液菌落的數(shù)目,最終的計量單位為菌落形成單位(clonal formation unit,CFU)。

    1.5 炎癥因子檢測 取造模成功后小鼠40只,每組10只,造模12 h后,各組通過摘眼球法采血1 mL,3 000 r/min離心15 min后取血清置于EP管中-80℃凍存,用于檢測血清IL-6及TNF-α。

    1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(Western blot)檢測HMGB1 分組同1.4。造模12 h后,各組通過摘眼球法采集血液標本,離心后取血清置于EP管中-80℃凍存待測。Western blot測定血清中HMGB1的表達,小鼠血清經(jīng)與適量上樣緩沖液混勻,經(jīng)電泳后,應(yīng)用濕式電轉(zhuǎn)移法進行轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉封閉,洗膜后,加入兔抗小鼠HMGB1抗體孵育;洗膜后,加入羊抗兔IgG/HRP孵育;洗膜后,顯色曝光并掃描成像,同時以β-Tubulin為內(nèi)參進行校準。利用Image J圖像分析軟件計算條帶灰度值,以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

    1.7 肝腎功能檢測 分組同1.5。造模12 h后,各組通過摘眼球法采集血液標本,離心并吸取血清于干凈的EP管中,立即送檢,采用自動生化分析儀檢測各組血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、血肌酐(CR)水平。

    1.8 病理切片 分組同1.5。造模12 h后,取各組小鼠肺、肝、腎組織常規(guī)制作病理切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,在光鏡下觀察并照相。

    1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間多重比較用Tukey法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組血細菌培養(yǎng) 對照組小鼠血液中未檢出細菌,DH5α組、44102組、25922組細菌量分別為(單位CFU)76.00±20.70、339.00±91.02和1 076±165.09,呈依次增多趨勢(F=107.168,P<0.01)。

    2.2 各組IL-6、TNF-α釋放水平 DH5α組、44102組、25922組的IL-6、TNF-α均高于對照組(P<0.01);DH5α組、44102組、25922組TNF-α、IL-6均呈依次增高趨勢(P<0.05),見表1。

    Tab.1 Comparison of IL-6 and TNF-α between four groups表1 各組IL-6、TNF-α的比較 (n=10,ng/L,±s)

    Tab.1 Comparison of IL-6 and TNF-α between four groups表1 各組IL-6、TNF-α的比較 (n=10,ng/L,±s)

    **P<0.01;a與對照組比較;b與DH5α組比較,c與44102組比較,P<0.05;表2同

    組別對照組DH5α組44102組25922組F IL-6 67.02±4.90 92.92±4.64a 100.29±5.51ab 108.48±7.85abc 93.335**TNF-α 11.27±3.11 20.39±2.10a 25.34±2.93ab 30.84±3.70abc 76.047**

    2.3 各組HMGB1水平比較 DH5α組、44102組、25922組的HMGB1均高于對照組(P<0.05);DH5α組、44102組、25922組的HMGB1呈依次增高趨勢(P<0.05),見圖1。

    2.4 各組肝腎指標變化 DH5α組、44102組、25922組的ALT、AST、BUN、CR的水平均高于對照組(P<0.01);DH5α組、44102組、25922組ALT、AST、BUN、CR呈依次增高趨勢(P<0.05),見表2。

    2.5 HE染色觀察各組肺肝腎損傷情況 肺切片的肺泡結(jié)構(gòu)損傷程度由重到輕依次為25922組、44102組、DH5α組;肝切片炎性細胞浸潤程度由重到輕依次為25922組、44102組、DH5α組;腎切片顯示腎小球萎縮程度由重到輕依次為25922組、44102組、DH5α組。對照組肺、肝、腎組織無明顯損傷,見圖2。

    Fig.1 Quantitative histograms of HMGB1 protein expression and HMGB1/β-Tubulin in four groups圖1 各組HMGB1蛋白表達及HMGB1/β-Tubulin的量化柱形圖

    Tab.2 Comparison of ALT,AST,BUN and CR between four groups表2 各組ALT、AST、BUN、CR的比較 (n=10,±s)

    Tab.2 Comparison of ALT,AST,BUN and CR between four groups表2 各組ALT、AST、BUN、CR的比較 (n=10,±s)

    **P<0.01;a與對照組比較,b與DH5α組比較,c與44102組比較,P<0.05

    組別對照組DH5α組44102組25922組F ALT(U/L)44.13±3.43 223.36±22.16a 243.75±17.56ab 263.45±11.11abc 436.887**AST(U/L)135.91±6.04 294.36±25.31a 323.38±18.23ab 348.02±10.61abc 325.568**BUN(mmol/L)7.93±0.44 31.74±1.43a 33.77±2.16ab 36.45±1.24abc 823.042**CR(μmol/L)17.06±1.49 40.41±1.46a 43.28±2.16ab 46.47±2.08abc 537.616**

    3 討論

    研究顯示,通過腹腔接種細菌可形成相對局限的感染灶,誘發(fā)膿毒癥,且血流動力學和代謝改變與臨床相似[5]。然而,腹腔注射細菌形成的膿毒癥模型仍存在同種屬動物對不同類型的細菌反應(yīng)存在差異的問題。所以比較不同類型細菌誘導(dǎo)的膿毒癥模型損傷程度,為選擇誘導(dǎo)膿毒癥模型的細菌提供指導(dǎo),這不僅可提高基礎(chǔ)研究的嚴謹性,而且有利于基礎(chǔ)研究更好地貼近臨床。

    細菌可以釋放內(nèi)毒素,內(nèi)毒素直接或間接參與重要臟器損傷,宿主中血細菌培養(yǎng)較多,其引起的膿毒癥模型可能會更重。膿毒癥時體內(nèi)細菌釋放內(nèi)毒素,內(nèi)毒素可導(dǎo)致肝臟急性微血管反應(yīng)以及肝細胞腫脹損害等現(xiàn)象[8,10],表現(xiàn)為肝細胞壞死、轉(zhuǎn)氨酶升高等[11-12]。內(nèi)毒素以及各種炎性介質(zhì)入血之后,可導(dǎo)致肺循環(huán)血液流速減慢,出現(xiàn)肺臟損傷[13]。腎血流量減少被認為是膿毒癥急性腎衰竭的中心環(huán)節(jié),內(nèi)毒素可使線粒體腫脹,細胞生物氧化功能受損[14]。目前,膿毒癥動物模型仍有缺陷,如缺乏適當?shù)募膊》制?,隨著膿毒癥的發(fā)展;疾病的嚴重程度也會發(fā)生變化,這也是靶向治療的主要障礙,適當?shù)臅r機和具體的階段性治療能提高膿毒癥動物模型的有效性[15]。

    Fig.2 Observation of lung,liver and kidney tissues in four groups under light microscope(HE,×200)圖2 各組肺肝腎組織光鏡下觀察(HE,×200)

    本研究結(jié)果顯示,3組細菌誘導(dǎo)的膿毒癥模型血細菌培養(yǎng)由高到低依次為大腸桿菌25922、44102及DH5α,肝腎功能以及肺肝腎病理結(jié)果顯示,3組小鼠膿毒癥模型均出現(xiàn)了重要臟器的急性損傷,且細菌培養(yǎng)的數(shù)量與臟器損傷的嚴重程度呈正向關(guān)系,表明大腸桿菌25922增殖能力較強,對宿主的侵襲力最強,引起臟器損傷最嚴重,大腸桿菌DH5α增殖能力和侵襲力相對較弱,臟器損傷相對較輕,大腸桿菌44102的增殖能力、侵襲力,以及引起的臟器損傷介于大腸桿菌25922和大腸桿菌DH5α之間,提示大腸桿菌25922、44102、DH5α可分別用于誘導(dǎo)臟器嚴重損傷、中等損傷以及輕微損傷的膿毒癥模型。

    相關(guān)研究表明,膿毒癥發(fā)病早期過強的炎癥反應(yīng)被認為是導(dǎo)致患者病情惡化和不良預(yù)后的關(guān)鍵因素,IL-6、TNF-α是主要的促炎因子,過強的炎癥反應(yīng)如果得不到控制會造成“細胞因子風暴”并引起促炎和抗炎失衡[16];IL-6、TNF-α炎癥因子作為早期炎癥因子,可直接或間接地損傷重要臟器[17-20]。HMGB1為近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的晚期炎癥介質(zhì),其不僅介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[21],還可以與各種炎癥因子相互作用引起級聯(lián)反應(yīng)[22],與膿毒癥嚴重程度和預(yù)后關(guān)系密切[23]。另外,有研究認為部分患者并非死于膿毒癥急性炎癥風暴期,而是在膿毒癥長期的免疫抑制階段,形成器官功能障礙甚至死于二次感染[24]。本研究結(jié)果顯示,25922組膿毒癥模型產(chǎn)生促炎因子IL-6、TNF-α以及晚期炎癥因子HMGB1能力最強,44102組產(chǎn)生IL-6、TNF-α、HMGB1能力介于25922組和DH5α組之間,DH5α組膿毒癥模型產(chǎn)生IL-6、TNF-α、HMGB1能力相對較弱,表明大腸桿菌誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)強度與臟器損傷成正向關(guān)系,25922組引起的膿毒癥模型因炎癥反應(yīng)強烈,臟器損傷較重,DH5α組釋放炎癥因子水平相對較低,損傷相對較輕,44102組釋放炎癥因子水平、臟器損傷程度介于25922組和DH5α組之間,提示大腸桿菌25922可能適用于研究膿毒癥初期炎癥風暴階段的動物模型;大腸桿菌DH5α可能適用于探索膿毒癥免疫抑制期治療方法的動物模型;大腸桿菌44102可能適用于無需限定膿毒癥分期實驗的動物模型。

    [1]Septimus EJ,Coopersmith CM,Whittle J,et al.Sepsis national hospital inpatient quality measure(SEP-1):multistakeholder work group recommendations for appropriate antibiotics for the treatment of sepsis[J].Clin Infect Dis,2017,65(9):1565-1569.doi:10.1093/cid/cix603.

    [2]Taneja I,Reddy B,Damhorst G,et al.Combining biomarkers with EMR data to identify patients in different phases of sepsis[J].Sci Rep,2017,7(1):10800.doi:10.1038/s41598-017-09766-1.

    [3]Singer M,Deutschman CS,Seymour CW,et al.The third international consensus definitions for sepsis and septic shock(Sepsis-3)[J].JAMA,2016,315(8):801-810.doi:10.1001/jama.2016.0287.

    [4]Chen L,Lu Y,Zhao L,et al.Curcumin attenuates sepsis-induced acute organ dysfunction by preventing inflammation and enhancing the suppressive function of Tregs[J].Int Immunopharmacol,2018,61(17):1-7.doi:10.1016/j.intimp.2018.04.041.

    [5]Kingsley SM,Bhat BV.Differential paradigms in animal models of sepsis[J].Curr Infect Dis Rep,2016,18(9):26.doi:10.1007/s11908-016-0535-8.

    [6]Tai LH,Ananth AA,Seth R,et al.Sepsis increases perioperative metastases in a murine model[J].BMC Cancer,2018,18(1):277.doi:10.1186/s12885-018-4173-4.

    [7]Fink MP.Animal models of sepsis[J].Virulence,2014,5(1):143-153.doi:10.4161/viru.26083.

    [8]Weinbren MJ,Collins M,Heathcote R,et al.Optimization of the blood culture pathway:a template for improved sepsis management and diagnostic antimicrobial stewardship[J].J Hosp Infect,2018,98(3):232-235.doi:10.1016/j.jhin.2017.12.023.

    [9]Deng D,Li X,Liu C,et al.Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics[J].Int Immunopharmacol,2017,42(1):49-58.doi:10.1016/j.intimp.2016.11.011.

    [10]Ge P,Yao X,Li J,et al.Diminazene aceturate alleviated lipopolysaccharide/D-galactosamine-induced fulminant hepatitis in mice[J].Biomed Pharmacother,2017,98(2):142-148.doi:10.1016/j.biopha.2017.12.034.

    [11]Li J,Xia K,Xiong M,et al.Effects of sepsis on the metabolism of sphingomyelin and cholesterol in mice with liver dysfunction[J].Exp Ther Med,2017,14(6):5635-5640.doi:10.3892/etm.2017.5226.

    [12]Zhao Y,Zhu H,Wang H,et al.FC-99 ameliorates sepsis-induced liver dysfunction by modulating monocyte/macrophage differentiation via Let-7a related monocytes apoptosis[J].Oncotarget,2018,9(19):14959-14976.doi:10.18632/oncotarget.24127.

    [13]Chen X,Cai X,Le R,et al.Isoliquiritigenin protects against sepsisinduced lung and liver injury by reducing inflammatory responses[J].Biochem Biophys Res Commun,2018,496(2):245-252.doi:10.1016/j.bbrc.2017.11.159.

    [14]Li T,Zhao J,Miao S,et al.Dynamic expression and roles of sequestome 1/p62 in LPS-induced acute kidney injury in mice[J].Mol Med Rep,2018,17(6):7618-7626.doi:10.3892/mmr.2018.8809.

    [15]Zurfluh S,Baumgartner T,Meier MA,et al.The role of metabolomic markers forpatients with infectious diseases:implications for risk stratification and therapeutic modulation[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2018,16(22):133-142.doi:10.1080/14787210.2018.1426460.

    [16]Chousterman BG,Swirski FK,Weber GF.Cytokine storm and sepsis disease pathogenesis[J].Semin Immunopathol,2017,39(5):517-528.doi:10.1007/s00281-017-0639-8.

    [17]Barre M,Behnes M,Hamed S,et al.Revisiting the prognostic value of monocyte chemotactic protein 1 and interleukin-6 in the sepsis-3 era[J].J Crit Care,2018,43(2):21-28.doi:10.1016/j.jcrc.2017.08.024.

    [18]Gao N,Dong L.MicroRNA-146 regulates the inflammatory cytokines expression in vascular endothelial cells during sepsis[J].Pharmazie,2017,72(11):700-704.doi:10.1691/ph.2017.7600.

    [19]Tanaka T, NarazakiM, Kishimoto T.Immunotherapeutic implications of IL-6 blockade for cytokine storm [J].Immunotherapy,2016,8(8):959-970.doi:10.2217/imt-2016-0020.

    [20]Cavaillon JM.Exotoxins and endotoxins:Inducers of inflammatory cytokines[J].Toxicon,2017,pii:S0041-0101(17)30313-6.doi:10.1016/j.toxicon.2017.10.016.

    [21]Yanai H,Chiba S,Hangai S,et al.Revisiting the role of IRF3 in inflammation and immunity by conditional and specifically targeted gene ablation in mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2018,115(20):5253-5258.doi:10.1073/pnas.1803936115.

    [22]Andersson U,Yang H,Harris H,et al.Extracellular HMGB1 as a therapeutic target in inflammatory diseases[J].Expert Opin Ther Targets,2018,22(3):263-277.doi:10.1080/14728222.2018.1439924.

    [23]Tzialla C,Manzoni P,Achille C,et al.New diagnostic possibilities for neonatal sepsis[J].Am J Perinatol.2018,35(6):575-577.doi:10.1055/s-0038-1639361.

    [24]Horiguchi H,Loftus TJ,Hawkins RB,et al.Innate immunity in the persistent inflammation,immunosuppression,and catabolism syndrome and its implications for therapy[J].Front Immunol,2018,9:595.doi:10.3389/fimmu.2018.00595.

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