PI3K/AKT信號(hào)通路在大鼠腹腔感染性膿毒癥急性腎損傷中的作用

楊蕊，許華，王兵，王勇強(qiáng)△

膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，是重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）患者死亡的首要因素［1］。其中腎臟是最常受累的器官之一，急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）常常是預(yù)測(cè)膿毒癥患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。白細(xì)胞介素（IL）-1β及IL-18作為炎癥形成早期的主要促炎因子［2］，其釋放受半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（Caspase-1）的調(diào)控，而后者又與Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體密切相關(guān)［3］。作為一種蛋白復(fù)合物，NLRP3炎性小體包括NLRP3、Caspase-1和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路在炎癥反應(yīng)過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，其活化后可誘導(dǎo)NLRP3炎性小體表達(dá)升高［4］。本研究通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔法（cecal ligation and puncture，CLP）復(fù)制大鼠腹腔感染性膿毒癥模型，并通過(guò)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)確認(rèn)AKI的發(fā)生，進(jìn)而探討PI3K/AKT通路及NLRP3炎性體激活在大鼠腹腔感染性膿毒癥相關(guān)AKI發(fā)病中的作用，為防治膿毒癥AKI提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠70只，8～10周齡，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，所有大鼠均在同一實(shí)驗(yàn)室按照清潔級(jí)要求適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫（20±1）℃，濕度（60±10）%，每日光照12 h。所有大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（n=10）、CLP 24 h組（n=20）、CLP 48 h組（n=20）、CLP 72 h組（n=20）。

1.1.2 主要試劑及儀器 ABI-7500 Real-time PCR檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；EPS300電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；FluorChemFC2型顯影儀購(gòu)自美國(guó)Alpha Innotech公司；Real-time PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)CWbio公司；兔抗大鼠NLRP3多克隆抗體、山羊抗大鼠ASC多克隆抗體、兔抗大鼠Caspase-1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)abbkine公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β及IL-18酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)RayBiotech公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體、兔抗山羊抗體、兔抗小鼠抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 根據(jù)Rittirsch等［5］報(bào)道的方法建立CLP誘導(dǎo)的大鼠腹腔感染性膿毒癥模型。所有動(dòng)物造模均在上午8:00—10:00進(jìn)行，術(shù)前禁食不禁水，用5%水合氯醛溶液（6 mL/kg）對(duì)大鼠腹腔注射進(jìn)行麻醉，腹正中切口切開(kāi)1 cm，識(shí)別盲腸并將其拉出，在盲腸總長(zhǎng)度50%處進(jìn)行結(jié)扎，用18號(hào)針頭在結(jié)扎線下5 mm處進(jìn)行穿刺后將盲腸放回腹腔并關(guān)腹。假手術(shù)組操作與CLP組相同，但不進(jìn)行盲腸結(jié)扎及穿孔。分別觀察假手術(shù)組和CLP各組大鼠的外觀形態(tài)、活動(dòng)、飲食等情況。假手術(shù)組大鼠全部存活，CLP 24 h組死亡7只，CLP 48 h組死亡11只，CLP 72 h組死亡13只。

1.2.2 樣本采集 在術(shù)后24、48、72 h對(duì)CLP各組及假手術(shù)組的存活大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，以2 000 r/min離心15 min后留取血清備用。大鼠處死后摘取腎臟組織，剪碎后凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 腎臟功能檢測(cè) 在術(shù)后24、48、72 h取血應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平。

1.2.4 腎臟組織PI3K/AKT mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 取50～100 mg冷凍腎臟組織，按照試劑盒說(shuō)明書先提取總RNA，之后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。所有產(chǎn)物作為Real-time PCR的模板。根據(jù)NCBI基因庫(kù)查詢到的基因mRNA序列，用Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物（表1），進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參，用ABI 7500 Real-time PCR System進(jìn)行檢測(cè)，采集熒光信號(hào)制作融解曲線，所得Ct值用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

Tab.1 Real-time PCR primer sequences of PI3K/AKT表1 PI3K/AKT Real-time PCR引物序列

1.2.5 腎臟組織NLRP3炎性小體蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot，WB）測(cè)定腎臟組織蛋白表達(dá)水平。組織冰上勻漿并裂解蛋白，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA蛋白定量，取20 μL蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉并孵育一抗4℃過(guò)夜；次日TBST洗膜后將膜與辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的抗IgG抗體孵育，室溫?fù)u床上輕搖2 h，再用TBST洗膜，加顯影液顯影。采用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值得到目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 血清IL-1β、TNF-α及IL-18水平檢測(cè) 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清IL-1β、TNF-α及IL-18水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟組織一般情況及功能指標(biāo) 腹腔解剖可見(jiàn)，CLP各組大鼠腎臟組織呈暗紅色，可見(jiàn)明顯充血及腫脹。假手術(shù)組血Cr及BUN水平較低且平穩(wěn)，與假手術(shù)組相比，CLP各組Cr及BUN水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。表明膿毒癥AKI模型制備成功。

Tab.2 Changes of serum levels of creatinine and blood urea nitrogen in four groups表2 各組大鼠血Cr及BUN變化 （±s）

Tab.2 Changes of serum levels of creatinine and blood urea nitrogen in four groups表2 各組大鼠血Cr及BUN變化 （±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與CLP24 h比較，c與CLP48 h比較，P＜0.05；表3～5同

n組別假手術(shù)組CLP 24 h組CLP 48 h組CLP 72 h組F 10 13 9 7 Cr（μmol/L）45.79±7.63 79.40±5.96a 80.42±8.87a 82.88±9.78a 66.249＊＊BUN（mmol/L）7.78±1.53 18.35±2.21a 20.97±2.05ab 24.53±1.79abc 115.448＊＊

2.2 各組大鼠腎臟組織PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平 假手術(shù)組大鼠腎臟組織PI3K、AKT mRNA的表達(dá)水平較低；與假手術(shù)組相比，CLP各組PI3K、AKT的mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

Tab.3 The expression levels of PI3K and AKT mRNA in kidney tissues in four groups表3 各組大鼠腎臟組織中PI3K、AKT的mRNA表達(dá)水平（±s）

Tab.3 The expression levels of PI3K and AKT mRNA in kidney tissues in four groups表3 各組大鼠腎臟組織中PI3K、AKT的mRNA表達(dá)水平（±s）

n組別假手術(shù)組CLP 24 h組CLP 48 h組CLP 72 h組F 10 13 9 7 PI3K 1.19±0.03 1.54±0.31a 2.26±0.52ab 3.38±0.37abc 63.331＊＊AKT 1.02±0.17 1.46±0.24a2.38±0.19ab 3.21±0.27abc 166.134＊＊

2.3 各組大鼠腎臟組織NLRP3炎性小體蛋白表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比，CLP各組的NLRP3、ASC及Caspase-1的表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖1。

Tab.4 The expression levels of NLRP3/ASC/Caspase-1 in kidney tissues in four groups表4 各組大鼠腎臟組織中NLRP3/ASC/Caspase-1的蛋白表達(dá)水平 （%，±s）

Tab.4 The expression levels of NLRP3/ASC/Caspase-1 in kidney tissues in four groups表4 各組大鼠腎臟組織中NLRP3/ASC/Caspase-1的蛋白表達(dá)水平 （%，±s）

n組別假手術(shù)組CLP 24 h組CLP 48 h組CLP 72 h組F 10 13 9 7 NLRP3 10±4 72±3a 71±4a 79±6abc 633.397＊＊ASC 2±1 88±3a 94±6a 95±3ab 1 231.863＊＊Caspase-1 8±3 76±2a 78±1ab 82±6ab 992.553＊＊

2.4 各組大鼠血清炎癥因子表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比，CLP各組的血清TNF-α、IL-1β及IL-18水平均顯著升高（P＜0.01）。其中CLP 48、72 h組IL-1β水平較24 h組升高，而IL-18水平則出現(xiàn)下降（P＜0.01），見(jiàn)表5。

Fig.1 The expression levels of NLRP3/ASC/caspase-1 in kidney tissues of each group圖1 各組大鼠腎臟組織中NLRP3/ASC/caspase-1的蛋白表達(dá)水平

Tab.5 The serum expression levels of TNF-α,IL-1β and IL-18 in four groups表5 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平（ng/L，±s）

Tab.5 The serum expression levels of TNF-α,IL-1β and IL-18 in four groups表5 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平（ng/L，±s）

n組別假手術(shù)組CLP 24 h組CLP 48 h組CLP 72 h組F 10 13 9 7 TNF-α 33.76±3.46 346.86±10.97a 339.55±13.32a 349.68±6.17ac 2 834.366＊＊IL-1β 35.39±4.62 88.42±11.07a 105.45±8.61ab 104.01±10.21ab 117.445＊＊IL-18 33.67±8.14 254.33±18.52a 207.67±14.18ab 164.03±9.08abc 483.999＊＊

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織不完全統(tǒng)計(jì)，發(fā)達(dá)國(guó)家膿毒癥發(fā)病率以每年8%～13%的速度急劇增加，且住院患者的病死率高達(dá)30%～60%，而高齡患者的病死率達(dá)50%以上［6］。膿毒癥以嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)為特征，而失控性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征的主要因素之一。腎臟是炎癥因子首要攻擊的靶器官之一［7］，其內(nèi)皮細(xì)胞被激活后會(huì)產(chǎn)生炎癥因子。傳統(tǒng)意義上認(rèn)為腎臟損傷是血流動(dòng)力學(xué)改變導(dǎo)致的腎臟缺血［8］，但近年來(lái)的研究認(rèn)為，膿毒癥AKI的發(fā)生主要與應(yīng)激激素、炎性介質(zhì)、內(nèi)毒素、內(nèi)皮素、血管內(nèi)皮與一氧化氮合酶、活性氧簇等有關(guān)［9］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)與大鼠腎臟功能相關(guān)的指標(biāo)Cr、BUN，證實(shí)腹腔感染性膿毒癥造成了AKI，進(jìn)而對(duì)腎臟組織內(nèi)的PI3K/AKT信號(hào)通路及NLRP3炎性小體進(jìn)行檢測(cè)，明確其在膿毒癥AKI發(fā)生發(fā)展中的作用。

機(jī)體在缺氧、感染或饑餓時(shí)利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)，為細(xì)胞修復(fù)及更新提供原料與營(yíng)養(yǎng)，保持能量穩(wěn)態(tài)，而PI3K/AKT是影響這個(gè)過(guò)程的重要信號(hào)通路。PI3K屬于脂質(zhì)激酶家族，能使肌醇環(huán)第3位羥基磷酸化為磷脂酰肌醇激酶。AKT是絲氨酸/蘇氨酸激酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖、凋亡等活動(dòng)。PI3K/AKT通路活化后可激活固有免疫系統(tǒng)，而模式識(shí)別受體是固有免疫系統(tǒng)激活的必備條件［10］。NLRP3炎性小體作為胞漿內(nèi)的一種模式識(shí)別受體，主要是由NLRP3、銜接蛋白ASC及Caspase-1三部分組成的蛋白復(fù)合物［11］。研究表明在炎癥反應(yīng)中抑制PI3K/AKT通路后NLRP3的表達(dá)降低，IL-1β釋放量顯著減少［12］。本次研究亦證實(shí)，與假手術(shù)組相比，CLP各組大鼠腎臟組織PI3K、AKT的mRNA的表達(dá)水平明顯升高，CLP各組大鼠腎臟組織NLRP3、ASC及Caspase-1的表達(dá)水平也顯著升高，表明在膿毒癥AKI時(shí)PI3K/AKT活化并激活其下游的NLRP3炎性小體，使其釋放量明顯增加，從而加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

在膿毒癥中TNF-α、IL-1β和IL-18是具有診斷和預(yù)測(cè)價(jià)值的炎癥因子［13］。IL-18屬于IL-1家族的促炎癥因子，主要由巨噬細(xì)胞釋放并誘導(dǎo)干擾素（IFN）-γ，IFN-γ通過(guò)合成NO發(fā)揮抗菌和抗病毒作用［14］。Vanden Berqhe等［10］利用IL-1β/IL-18基因敲除的小鼠建立CLP膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)同時(shí)缺乏IL-1β和IL-18的小鼠由于自身具有保護(hù)性而不表現(xiàn)出膿毒癥癥狀。本研究顯示，與假手術(shù)組相比，CLP各組的IL-1β、TNF-α及IL-18水平均顯著升高（P＜0.01），考慮膿毒癥AKI時(shí)有大量的炎性介質(zhì)釋放，其中IL-1β和IL-18水平的迅速升高可能與炎性小體活化有關(guān)。但本次研究未檢測(cè)膿毒癥AKI早期的細(xì)胞因子水平及炎性小體釋放量的變化。

綜上所述，在大鼠腹腔感染性膿毒癥AKI模型中PI3K/AKT通路介導(dǎo)NLRP3炎性小體表達(dá)增加，進(jìn)而使其下游炎癥因子釋放增加而加重膿毒癥AKI癥狀，提示PI3K/AKT在一定程度上參與膿毒癥AKI病情的進(jìn)展，IL-1β、IL-18可在一定意義上提示膿毒癥AKI病情的嚴(yán)重程度，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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