對陰道加德納菌、白色假絲酵母菌有抑制作用的人陰道乳酸桿菌的篩選和功能

王則緋，譚宏偉

(1 陜西省第四人民醫(yī)院，西安710043；2 西北婦女兒童醫(yī)院)

健康女性陰道是一個復雜的微生態(tài)環(huán)境，定植著益生菌和條件致病菌[1]。乳酸桿菌在健康女性陰道中占有絕對優(yōu)勢，黏附于陰道上皮細胞，通過競爭排斥和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等抑制病原菌生長[2]。但是在某些因素，如雌激素水平降低、不潔性行為、抗生素濫用等作用下，陰道微生態(tài)平衡被破壞，導致一些條件致病菌過度生長，引起陰道疾病，如細菌性陰道病(BV)和外陰陰道念珠菌病(VVC)等[3～5]。研究顯示，陰道加德納菌(Gv)和白色假絲酵母菌(Ca)分別是BV和VVC的主要致病菌，因此常將其作為指示菌[6，7]。盡管近十年來國內(nèi)外日益重視益生菌的研究和開發(fā)，但是關(guān)于乳酸桿菌抑制細菌生長的機理仍有待進一步研究。國內(nèi)部分研究顯示了乳酸桿菌在體內(nèi)和體外的抗菌效果[8]，但是迄今為止，我國上市的陰道乳酸桿菌活菌制劑僅有德氏乳桿菌DM8909(商品名：定君生)一種，因此有必要繼續(xù)開發(fā)有利于預防和治療女性泌尿生殖道感染的乳酸桿菌制劑。本研究首先從本地健康婦女陰道分泌物中篩選出抑Gv/Ca效果明顯的8株乳酸桿菌，然后觀察其產(chǎn)生過氧化氫的能力、產(chǎn)生乳酸的能力、自聚合/共聚合能力以及產(chǎn)生生物膜的能力?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 陰道分泌物標本取自2017年1～6月在我院門診接受孕前檢查的女性。排除標準：①處于月經(jīng)期；②1個月內(nèi)使用抗生素或者抗真菌藥物者；③1個月內(nèi)口服或者外用避孕藥者；④48 h內(nèi)曾經(jīng)陰道用藥或者陰道沖洗者；⑤半年內(nèi)曾經(jīng)被診斷過婦科或者泌尿系統(tǒng)炎癥性疾病者；⑥婦科檢查發(fā)現(xiàn)陽性體征者。符合上述標準的女性留取陰道后穹窿分泌物，行相關(guān)檢查除外細菌性陰道病、滴蟲性陰道炎、外陰陰道念珠菌病和性病、梅毒患者。共30例婦女納入本研究，入組者年齡18～30歲。取入組者陰道后穹窿分泌物標本進行后續(xù)實驗。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，入組者均簽署知情同意書。

1.2 具有抑Gv/Ca菌活性的人陰道乳酸桿菌的篩選

1.2.1 人陰道乳酸桿菌菌株的分離和純化 將符合標準的健康女性陰道分泌物接種于MRS培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱中37℃厭氧培養(yǎng)(85 % N2、10 % H2和5 % CO2)48 h。挑選疑似乳酸桿菌菌落進行革蘭染色，疑似乳酸桿菌菌落具有如下特征：革蘭染色陽性，無芽孢，呈桿狀或球桿狀，單個、成對或者柵欄狀排列，無動力；白色或乳白色菌落，呈圓形、扁平或者隆起、邊緣整齊、不透明；硝酸鹽還原實驗和觸酶實驗陰性，吲哚陰性，不液化明膠。用平板劃線法進行分離培養(yǎng)。經(jīng)過3～4個增菌-平板分離-再增菌-再平板分離的循環(huán)后得到純菌種。

1.2.2 獲得乳酸菌株分型 采用16S rDNA基因測序法將乳酸桿菌在MRS培養(yǎng)基中復蘇并活化培養(yǎng)3代，用試劑盒法提取其基因組。以細菌16S rRNA基因高保守區(qū)為靶點, 所選寡聚核苷酸引物為SAdir：5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′和S17rev：5′-GTTACCTTGTTACGACTT-3′，對該引物擴增出16S rRNA序列片段。擴增體系體積50 μL，含有200 μmol/L的dNTP，上下游引物各2 μmol/L，100 ng模板DNA， 2.5 U Taq DNA聚合酶，5 μL 10×PCR緩沖液 。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃孵育 3 min，然后 94 ℃ 60 s、50 ℃ 90 s、72 ℃ 2 min共30個循環(huán)，72 ℃終延伸6 min。PCR產(chǎn)物行0.8 %(w/v)瓊脂糖/TAE凝膠電泳，陽性者送北京華大基因公司進行雙向測序。用 BLAST程序進行NCBI位點分析，測序結(jié)果與GenBank中的序列相比較，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類菌種，從而確定菌株類型。

1.2.3 獲得乳酸桿菌菌株對指示菌的抑菌活性檢測 采用雙層瓊脂擴散法評價篩選出的乳酸桿菌對指示菌(10種細菌和5種假絲酵母菌)的抑菌效果。各指示菌(細菌和假絲酵母菌)的培養(yǎng)條件如下：陰道加德納菌、羞怯動彎桿菌和中間普雷沃菌培養(yǎng)選擇布氏肉湯，包含1%蛋白胨5號、0.2% Tween 80，0.3 %肉浸液、0.5 %血晶素、0.1 %維生素K和3 %馬血清。脆弱擬桿菌和普通擬桿菌培養(yǎng)選擇腦心浸液肉湯(BHI肉湯)，包含0.5 %血晶素和0.1 %維生素K。在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。無乳鏈球菌、糞腸球菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)選擇BHI肉湯,在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h。白色假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、克魯斯氏假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌培養(yǎng)選擇沙氏葡萄糖肉湯。在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h。將乳酸桿菌(濃度109CFU/mL)接種于MRS固體培養(yǎng)基表面特定位置，于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。加入指示菌(細菌濃度109CFU/mL、假絲酵母菌濃度107CFU/mL)菌液的特定培養(yǎng)基混合液，通過無菌移液管至已接入乳酸桿菌的平皿中，在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察有無抑菌圈并測量抑菌圈直徑，從而篩選出對Gv/Ca有抑菌活性的乳酸桿菌。

1.3 有抑Gv/Ca菌活性的人陰道乳酸桿菌功能的觀察

1.3.1 對Gv/Ca抑菌活性的定量觀察 取篩選出的乳酸桿菌培養(yǎng)懸浮液或上清液與Gv或Ca進行共孵育實驗。所篩選乳酸桿菌菌株、Gv和Ca離心后，用無菌PBS洗滌3次后，重懸于各自新鮮肉湯中，使?jié)舛确謩e達到：乳酸桿菌108CFU/ mL或106CFU/mL、Gv 108CFU/ mL、Ca 106CFU/mL。乳酸桿菌培養(yǎng)上清液用0.22 μm濾膜過濾除菌后4 ℃保存?zhèn)溆?。? mL的乳酸桿菌懸浮液或者上清液，與等體積等濃度的Gv或者Ca在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中共孵育18 h。將乳酸桿菌、Gv或Ca培養(yǎng)液作10倍梯度稀釋并分別涂布MRS、Vaginalis瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)上。陽性對照為等量Gv或Ca用等量新鮮MRS培養(yǎng)基孵育。

1.3.2 產(chǎn)過氧化氫(H2O2)能力觀察 將篩選出的乳酸桿菌濃度調(diào)定為109CFU/ mL。將0.5 mL菌液接種到含0.25 mg/mL TMB和0.01 mg/mL HRP的3 mL MRS肉湯中，在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后常氧培養(yǎng)30 min。采用Edema等[10]所描述的方法進行定量分析。以嗜酸乳酸桿菌ATCC 4356作為陽性對照，培養(yǎng)基本身作為陰性對照。

1.3.3 產(chǎn)乳酸能力觀察 篩選出的乳酸桿菌菌液按1%比例接種于新鮮MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。經(jīng)離心測定上清液pH值。通過酸堿滴定法測量乳酸桿菌乳酸的產(chǎn)生量，方法如Edema MO[10]所述。以嗜酸乳酸桿菌ATCC 4356為陽性對照，培養(yǎng)基本身作為陰性對照。

1.3.4 自聚合和共聚合能力觀察 參考Kos等[11]的方法。所篩選乳酸桿菌菌株、Gv和Ca離心后，用無菌PBS洗滌3次后，重懸于各自新鮮肉湯中，使?jié)舛确謩e達到：乳酸桿菌109CFU/ mL或107CFU/mL、Gv 109CFU/ mL和Ca 107CFU/mL。4 mL細胞懸液(自聚合)或者乳酸桿菌和Gv各2 mL的混合懸液(共聚合)或者乳酸桿菌和Ca各2 mL的混合懸液(共聚合)，經(jīng)蝸旋10 s后，放置在室溫下孵育5 h。分別在0 h和5 h取樣測量其在 600 nm下的吸光度A值，分別記為A0和A5。自聚合能力(%)= [ 1-(A5/A0)]×100%。共聚合能力(%)=2{[(Ax+Ay)/2]-A(x+y)}/(Ax+Ay)×100%。其中，Ax和Ay分別為單個微生物的吸光度，A(x+y)是指乳酸桿菌與Gv或Ca混合微生物的吸光度。共聚合定性實驗500 μL乳酸桿菌與500 μL Gv或Ca混合，短暫蝸旋后，室溫下以50 r/min振蕩2 h。上清液進行革蘭染色，顯微鏡下觀察。存在大而濃厚的微生物叢定義為++，小而稀疏分散的微生物叢定義為+，無微生物叢定義為-。

1.3.5 生物膜形成能力觀察 參考Pérez-Ibarreche等[12]方法。乳酸桿菌菌株(109CFU /mL)用新鮮MRS按5% v/v稀釋后取200 μL加入無菌96孔平底細胞培養(yǎng)板中，每株接種4孔，設(shè)置空白對照(同體積無菌MRS)。在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。PBS洗板3次，將未黏附的乳酸桿菌洗去。晾干后，每孔加入200 μL的0.1 %結(jié)晶紫(w/v)染色30 min，去離子水沖洗未黏附的乳酸桿菌。晾干后每孔加入200 μL異丙醇-甲醇-PBS溶液(1∶1∶18)，輕微振蕩。去離子水沖洗2次，祛除過度染色。在酶標儀下讀取每孔570 nm處的吸光度值(OD)。以陰性對照孔的A值(ODc)作為參考，計算OD/Odc≤1為無生物膜形成能力，1～2為生物膜形成能力弱，2～4為生物膜形成能力中，4～8為生物膜形成能力強，>8為生物膜形成能力極強。

2 結(jié)果

2.1 有抑Gv/Ca菌活性的人陰道乳酸桿菌的篩選經(jīng)過及結(jié)果 30名健康女性陰道分泌物中分離出51株菌，其中23株具有乳酸桿菌特征。對23個乳酸桿菌進行16S rDNA基因測序，確定其中9個菌株為卷曲乳酸桿菌、7個菌株為植物乳酸桿菌、6個菌株為發(fā)酵乳酸桿菌、1個菌株為加氏乳酸桿菌。雙層瓊脂擴散實驗結(jié)果顯示，共有8個菌株對Gv和/或Ca有抑菌作用：包括僅抑制Gv的2號菌株、僅抑制Ca的7、26和44號菌株以及對同時抑制二者的16、19、31和41號菌株。上述8個菌株即為篩選出的有抑Gv/Ca菌活性的人陰道乳酸桿菌，其拮抗Gv、Ca的平均抑菌圈直徑分別為18.94 、13.97 mm。

2.2 篩選出的有抑Gv/Ca菌活性人陰道乳酸桿菌的功能

2.2.1 對Gv/Ca抑菌活性 2、7、16、31、41號菌株共培養(yǎng)、上清液培養(yǎng)對Gv的抑菌活性見表1。7、16、19、26、31、41、44號菌株共培養(yǎng)、上清液培養(yǎng)對Ca的抑菌活性見表2。篩選出的8種乳酸桿菌與Gv共培養(yǎng)時，全部菌株均顯示了抑菌活性，其中41號菌株完全抑制了Gv的生長；當用乳酸桿菌培養(yǎng)上清液孵育Gv時，全部菌株培養(yǎng)上清液均顯示了明顯地抑菌活性。當乳酸桿菌與Ca共培養(yǎng)時，全部菌株均顯示了抑菌活性；當乳酸桿菌培養(yǎng)上清液孵育Ca時，全部菌株培養(yǎng)上清液均顯示了抑菌活性，其中19號菌株完全抑制了Ca的生長。

2.2.2 產(chǎn)生H2O2、乳酸能力 各菌株pH值、乳酸生成量和H2O2生成量見表3。8個乳酸桿菌菌株pH值、乳酸生成量 和H2O2生成量與陰性對照菌株相比，P均<0.05。其中以19號和41號菌株的產(chǎn)酸和產(chǎn)H2O2能力最強，達到了陽性對照菌株水平(P均>0.05)。

表1 2、7、16、31、41號菌株共培養(yǎng)和上清液培養(yǎng)對Gv的抑菌活性

注：與陰性對照菌株相比，*P<0.05。

表2 7、16、19、26、31、41、44號菌株共培養(yǎng)和上清液培養(yǎng)對Ca的抑菌活性

注：與陰性對照菌株相比，*P<0.05。

表3 乳酸桿菌菌株培養(yǎng)上清液中pH值、乳酸和H2O2水平

注：與陽性對照菌株相比較，*P<0.05；與陽性對照菌株相比較，#P>0.05。

2.3 自聚合/共聚合水平 Gv的自聚合水平為45.25 %，而Ca的自聚合水平則高達100 %。乳酸桿菌菌株16號(92.57 %)、19號(96.32 %)、31號(92.16 %)和41號(93.52 %)均顯示了明顯的自聚合能力。19號、26號和41號菌株顯示了與Ca較強的共聚合能力(定性均為++，定量分別為61.23 %、58.72 %和54.59 %)，其他菌株與Ca的共聚合水平為28.53 % ～ 44.21 %。16號、19號和41號菌株顯示了與Gv較強的共聚合能力(定性均為++，定量分別為82.34 %、83.41 %和93.56 %)，其他菌株與Ca的共聚合水平為41.33%～46.12%。

2.4 細菌生物膜形成情況 篩選出的8種乳酸桿菌均能夠形成生物膜，其中19號菌株最強，其次是41號菌株。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，全球每年大約有10億女性患泌尿生殖道感染，目前的主要治療方法是抗生素。但是抗生素的長期使用往往導致陰道微生態(tài)失衡，療效不佳，且易復發(fā)。利用微生態(tài)療法選擇乳酸桿菌來恢復陰道菌群失調(diào)和預防感染，是一種安全而有效的手段[13]。目前我國上市的陰道乳桿菌活菌制劑僅有德氏乳桿菌DM 8909(商品名：定君生)一種，因此有必要繼續(xù)開發(fā)有利于預防和治療女性泌尿生殖道感染的乳酸桿菌制劑。

本研究從健康婦女陰道后穹窿分泌物中分離出的23株乳酸桿菌中包括9個卷曲乳酸桿菌、7個植物乳酸桿菌、6個發(fā)酵乳酸桿菌和1個加氏乳酸桿菌菌株。Gv是BV最常見的致病菌[6]，Ca是VVC和復發(fā)性VVC的主要致病菌[7]，故我們進一步篩選出對Gv和Ca具有較好抗菌活性的8株乳酸桿菌，并通過乳酸桿菌培養(yǎng)懸浮液和上清液與Gv或Ca共孵育的方法，進一步證實了它們較強的抗菌活性。

乳酸桿菌產(chǎn)生H2O2是防止病原微生物或機會致病微生物定植的一個重要機制[14]。在陰道分泌物中，H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镽OS，例如超氧陰離子、羥基自由基，它們對許多微生物(如Gv、Ca和淋球菌等)和病毒顆粒(如人類免疫缺陷病毒-1等)具有高度毒性[15]。乳酸桿菌生成H2O2減少與BV、復發(fā)性尿路感染和人類免疫缺陷病毒-1敏感性增加明顯相關(guān)。乳酸桿菌有機酸的生成對于維持陰道pH值<4.5是至關(guān)重要的。本研究也顯示篩選的8個乳酸桿菌菌株良好的產(chǎn)生乳酸和H2O2能力，并且可以保持培養(yǎng)液較低的pH值，這些結(jié)果與先前報道的陰道乳酸桿菌可以作為益生菌的內(nèi)容相一致。

生物膜是一種原核生物多細胞聚合形式，是在不利條件下細菌維持生存所形成的一種特殊結(jié)構(gòu)。與單個細菌分散的浮游形式不同，它附著在非生物或生物活性表面，由自身產(chǎn)生的多聚基質(zhì)包裹細胞群落。自聚合是指相同遺傳背景的細菌發(fā)生相互聚集，共聚合是指懸浮液中不同遺傳背景的細菌相互黏合在一起。對于致病菌來說，生物膜具有保護細菌、促進細菌逃避機體免疫和對抗抗菌藥物的作用。但是對于乳酸桿菌來說，生物膜形成和自聚合能力或許會產(chǎn)生有益效果，例如可能會增加乳酸桿菌在陰道上皮細胞的自身定植。本研究所篩選出的乳酸桿菌菌株均具有不同程度的自聚合和生物膜形成能力，其中19號和41號菌株的形成能力甚至達到了極強和強的標準。本研究也顯示了篩選出的乳酸桿菌與Gv和Ca有共聚合能力，這也是其防止病原菌黏附的一個重要機制。

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