盆舒顆粒對宮腔黏連模型大鼠子宮內(nèi)膜TGF-β 1、Smad3的影響

蔣敏，趙宏利，楊漢銘

杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007

宮腔黏連(IUA)是子宮內(nèi)膜的一種損傷性疾病，臨床表現(xiàn)為經(jīng)期腹痛、月經(jīng)量少、閉經(jīng)、不孕等[1]。近年來隨著人工流產(chǎn)率的增加，宮腔黏連發(fā)病率逐年上升。有報道指出：宮腔黏連的發(fā)生有90%以上系刮宮所致[2]，其發(fā)病機(jī)制可能與體內(nèi)促進(jìn)或抑制組織纖維化的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、金屬蛋白酶9(MMP-9)發(fā)生變化有關(guān)。本研究采用自制刮宮勺刮傷大鼠子宮內(nèi)膜，制作符合宮腔黏連發(fā)病機(jī)制的模型，觀察盆舒顆粒對宮腔黏連大鼠子宮TGF-β1、信號傳導(dǎo)蛋白(Smad3)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用成年雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量(230±20)g，由浙江省實驗動物中心提供，符合國家動物實驗設(shè)施屏障環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，動物實驗條件合格證號：SYXK(浙)2008-0113。

1.2 藥物、試劑和設(shè)備 中藥制劑“盆舒顆?！保僧?dāng)歸、炒白術(shù)、延胡索、紅藤、浙貝母、王不留行子等中藥組成，由杭州市中醫(yī)院制成顆粒劑。兔抗鼠TGF-β1抗體、兔抗鼠Smad3抗體、兔免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；光學(xué)顯微鏡(蔡司光學(xué)儀器上海國際貿(mào)易有限公司)。

1.3 分組和模型的建立 利用SPSS13.0軟件將選用的50只SD大鼠隨機(jī)分為5組，即正常組、模型組、中藥治療組，TGF-β1抗體干預(yù)組、TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治療組，每組10只。除正常組外，其他4組大鼠用戊巴比妥鈉(濃度為0.4%)腹腔注射麻醉大鼠(50mg/kg)后，無菌條件下，取下腹正中切口約0.8～1.0 cm，開腹后暴露并固定子宮，用自制小刮勺刮傷子宮內(nèi)膜，連續(xù)縫合完全關(guān)閉切口。需TGF-β1抗體干預(yù)的2組實驗大鼠在關(guān)腹前將TGF-β1抗體注入子宮后關(guān)腹。

1.4 造模后處理 各組大鼠均于造模后第2天開始灌胃給藥。中藥治療組、TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治療組：每天按體表面積給予等效劑量的盆舒顆粒，按每只大鼠10 g/(kg·d)灌胃給藥，正常組、模型組、抗體干預(yù)組給予等容量生理鹽水，共14天，中藥治療組、TGF-β1抗體干預(yù)組由于灌胃失誤導(dǎo)致各有1只大鼠死亡，其余各組大鼠無死亡，將大鼠稱體質(zhì)量后，開腹，手術(shù)摘取雙側(cè)子宮，將供HE染色、免疫組化檢測的組織放入到10%甲醛中固定。

1.5 HE染色及免疫組化法 HE染色方法：(1)烘片：37℃過夜；(2)脫蠟：二甲苯I，5min；二甲苯II，15min；無水酒精，1min；95%酒精，1min；80%酒精，2min；自來水洗，3次；(3)染色：蘇木素染液，5min；自來水洗，3次；伊紅酒精，2min；(4)透明、固封：80%酒精，1min；95%酒精I(xiàn)，2min；95%酒精 II，5 min；無水酒精 I，10 min；無水酒精 II，10 min；二甲苯I，5min；二甲苯II，5min；中性樹膠封片。免疫組織化學(xué)檢測方法：(1)60℃烤片2 h；(2)脫蠟，二甲苯脫蠟15min，3次；(3)水化，依次經(jīng)過無水乙醇，95%，90%，80%，70%，各5min，蒸餾水5min；(4)PBS洗5min，3次；(5)熱修復(fù)抗原：枸櫞酸鹽緩沖液(約92～95℃)煮沸(沸水浴)修復(fù)15min，自然涼至室溫。PBS洗5min，3次；(6)3%雙氧水封閉20 min，PBS洗5 min，3次；(7)正常山羊血清封閉，37℃ 20min；(8)一抗孵育，4℃ 過夜；(9)復(fù)溫20min，PBS洗5min，3次；(10)二抗孵育，37℃ 20min(二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG)PBS洗5min，3次；(11)DBA顯色；(12)蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法 采用光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠子宮組織的光鏡形態(tài)學(xué)變化，病理分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。采用免疫組化法檢測各組大鼠子宮組織中TGF-β1，Smad3表達(dá)情況。1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮病變程度比較 見表2。經(jīng)Ridit分析，除模型組外，其他各組Ridit值均小于0.5。模型組與正常組95%可信區(qū)間無重疊，說明有顯著性差異；模型組與中藥治療組、TGF-β1抗體干預(yù)組、TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治療組95%可信區(qū)間均無重疊，說明有顯著性差異；中藥治療組與TGF-β1抗體干預(yù)組、TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治療組95%可信區(qū)間重疊，說明無顯著性差異。結(jié)果還提示：3個治療組間存在療效差異，由于病變程度等級是按“好”到“差”排列，所以Ridit值最小者療效最優(yōu)，故TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治 療組療效最好。

表1 病理分級標(biāo)準(zhǔn)分

表2 各組大鼠子宮病變程度比較

2.2 各組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TGF-β1表達(dá)比較 見表3。與正常組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TGF-β1表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，中藥治療組、TGF-β1抗體干預(yù)組、TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治療組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TGF-β1表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。中藥治療組、TGF-β1抗體干預(yù)組、TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治療組3組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞ 0.05)。

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TGF-β1表達(dá)比較(±s)

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TGF-β1表達(dá)比較(±s)

與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常組模型組中藥治療組TGF-β1抗體干預(yù)組TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治療組n 10 10 99 10 TGF-β1 10.000 0±1.563 4 13.500 0± 0.849 8①11.444 4± 1.236 0②11.000 0± 1.500 0②10.500 0± 1.354 0②

2.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Smad3表達(dá)比較 見表4。與正常組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Smad3表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，中藥治療組、TGF-β1抗體干預(yù)組、TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治療組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Smad3表達(dá)顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。中藥治療組、TGF-β1抗體干預(yù)組、TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治療組3組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞ 0.05)。

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Smad3表達(dá)比較(±s)

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Smad3表達(dá)比較(±s)

與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常組模型組中藥治療組TGF-β1抗體干預(yù)組TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治療組n 10 10 99 10 Smad3 8.400 0±1.712 7 13.500 0± 1.354 0①9.555 6± 1.424 0②9.4444± 1.424 0②9.200 0± 1.316 5②

3 討論

宮腔黏連為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病名，散見于中醫(yī)月經(jīng)過少、閉經(jīng)、腹痛等病證之中。宮腔手術(shù)損傷胞宮氣血，擾亂腎—天癸—沖任—胞宮軸，導(dǎo)致腎氣虧損，精血匱乏，沖任失養(yǎng)，胞脈空虛，不能按時蓄溢；《景岳全書·婦人規(guī)》曰：“瘀血留滯作癥，唯婦人有之，其證則或由經(jīng)期，或由產(chǎn)后，凡內(nèi)傷生冷，或外受風(fēng)寒……總由血動之時，余血未凈，而一有所逆，則留滯日積，而漸以成癥矣”，而后余血未凈，邪氣乘虛入侵與血搏結(jié)，凝結(jié)成瘀，內(nèi)阻胞宮?，F(xiàn)代中醫(yī)研究表明，氣滯血瘀、脾虛失運、濕濁內(nèi)阻會引起黏連性腹痛[4]，也有學(xué)者認(rèn)為宮腔黏連術(shù)后月經(jīng)量少的主要病機(jī)以腎虛為本，血瘀為標(biāo)[5～6]。

本課題組在繼承古人理論的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)知識，根據(jù)宮腔黏連臨床表現(xiàn)及危害特點，歸納宮腔操作后宮腔黏連病因病機(jī)，主要為虛、瘀、濕三端。針對宮腔黏連的發(fā)病特點，運用傳統(tǒng)的中醫(yī)經(jīng)典理論，在繼承老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，總結(jié)“通經(jīng)養(yǎng)血，散結(jié)除濕”治法，創(chuàng)立中藥復(fù)方“盆舒顆粒”：當(dāng)歸乃補(bǔ)血之圣藥，和血補(bǔ)血；白芍養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛；白術(shù)為脾臟補(bǔ)氣健脾第一要藥；澤瀉、茯苓滲水利濕，利尿消腫；川芎是血中之氣藥，活血行氣止痛，善“下調(diào)經(jīng)水，中開郁結(jié)”；上六味源自《金匱要略》當(dāng)歸芍藥散，旨在疏肝健脾，活血化瘀，健脾利濕，佐以延胡索活血散瘀，利氣止痛；莪術(shù)破血行氣消積；紅藤清熱解毒除濕；使以牛膝逐瘀通經(jīng)，引血下行；浙貝母清熱化痰，散結(jié)消癰；王不留行子活血通經(jīng)。合方共奏活血化瘀、通經(jīng)祛濕止痛之效。

TGF-β是一種強(qiáng)效免疫抑制因子，在急性炎癥反應(yīng)中，該因子可以增加巨噬細(xì)胞對炎性細(xì)胞和受損傷實質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用，同時抑制組織中的巨噬細(xì)胞活性。TGF-β可直接增加間質(zhì)蛋白質(zhì)的合成與分泌，促進(jìn)膠原與基質(zhì)的黏附作用，參與最初的炎性反應(yīng)、血管形成、膠原沉積以及最終組織塑形，是誘導(dǎo)瘢痕形成的重要因子，在宮腔黏連患者子宮內(nèi)膜中呈高表達(dá)[7～8]。Smad蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的介質(zhì)，可將信號由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，使得TGF-β能在不同的環(huán)境下發(fā)揮它的多種功能，產(chǎn)生各種效應(yīng)[9]。TGF-β 發(fā)揮作用主要是通過與其靶細(xì)胞(主要是成纖維細(xì)胞)上的受體結(jié)合而激活TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)通路，使膠原過度沉積導(dǎo)致纖維化的發(fā)生發(fā)展。相關(guān)研究表明Smad3通路抑制劑的表達(dá)可以阻斷TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，該方法可能為纖維化疾病提供一種新的治療手段[10～11]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠子宮內(nèi)膜TGF-β1及Smad3較正常組顯著增高(P＜0.05)，中藥治療組、TGF-β1抗體干預(yù)組與TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治療組TGF-β1及Smad3的表達(dá)較模型組明顯降低(P＜0.05)。Smad3在子宮損傷大鼠子宮內(nèi)膜中呈高表達(dá)，中藥治療組、TGF-β1抗體干預(yù)組、TGF-β1抗體干預(yù)+中藥治療組子宮內(nèi)膜組織中的Smad3的表達(dá)受抑制，說明TGF-β1/Smad3信號環(huán)節(jié)是子宮黏連形成的途徑之一。中藥復(fù)方盆舒顆粒、TGF-β1抗體預(yù)防宮腔黏連的作用可能是通過抑制這一通路來實現(xiàn)的。

[1] 楊志偉，姜凱輝，周世英．宮腔內(nèi)粘連的診斷[J]．齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，29(16)：2011-2013．

[2] Kodaman PH，Arici A．Intra-uterine adhesions and fertility outcome： howto optimize success?[J]． Curr Opin Obstet Gynecol，2007，19(3)：207-214．

[3] 王靜，楊軍，劉超．盆腔炎顆粒對大鼠慢性子宮內(nèi)膜炎療效的研究[J]．中國實驗方劑學(xué)雜志，2006，12(1)：56-58．

[4] 陳奇．粘連性腹痛的辨治體會[J]．井岡山醫(yī)專學(xué)報，2005，12(1)：96-97．

[5] 葉青，高進(jìn)軍，郭瑞華．活血補(bǔ)腎法加宮腔鏡分離術(shù)治療宮腔粘連所致月經(jīng)過少、繼發(fā)性閉經(jīng)、繼發(fā)不孕57例臨床觀察[J]．中醫(yī)雜志，2007，48(9)：806-808．

[6] 江偉華，徐旭群．麝靈湯周期療法配合宮腔鏡治療宮腔粘連49例[J]．中國中醫(yī)藥科技，2007，14(3)：170．

[7] 谷慶陽．TGF-β 及其信號分子smad3在傷口愈合過程中的作用[J]．國外醫(yī)學(xué)：生理病理科學(xué)與臨床分冊，2002，22(1)：67-69．

[8] 劉琳琳，劉玉環(huán)，蔣東橋，等．CTGF和TGF-β1的表達(dá)與宮腔粘連形成的相關(guān)性[J]．山東醫(yī)藥，2012，52(12)：17-19．

[9] 陳琛，葉冬梅．轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad信號通路研究進(jìn)展[J]．醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2006，3(2)：126-128．

[10] 田建廣，雄杰，夏照帆．TGF-β1/Smad3信號通路與創(chuàng)傷修復(fù)[J]．中華損傷與修復(fù)雜志：電子版，2007，2(6)：349-350．

[11] 蘇麗婷，夏時海．Smad蛋白在轉(zhuǎn)化生長因子-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用與機(jī)制[J]．醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2008，5(4)：352-355．